駆除対象草本植物の飼料化に適した白色腐朽菌の分子育種

适合作为待灭草本植物饲料的白腐真菌的分子育种

基本信息

批准号：
22K05937
负责人：
入江俊一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Shiga Prefecture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒラタケにおいて組換えにあたらない遺伝子改変系を開発を目指すため、CRISPR/Cas9発現カセット遺伝子の一時的導入による目的遺伝子の破壊を試みた。その結果、複数の目的遺伝子破壊株を得ることができ、それらの多くにCas9遺伝子が含まれていなかった。これにより、RNPとは異なり選択マーカー遺伝子によりゲノム編集株を素早く選抜できる非組換え遺伝子改変系の開発につながる技術の開発ができた。シイタケは我が国においてヒラタケ以上に有名な食用担子菌である。種村らによると植物由来飼料に対する高い性能改善効果が期待される（種村ら　Aquaculture 2016;453:130-134）。しかし、ヒラタケ以上に遺伝子工学的実験手法の開発が遅れており、遺伝子機能解析に必須である遺伝子ターゲティングの成功例も存在しない。ドナーベクターのみ用いたシイタケpyrG遺伝子の相同組換え（HR）による破壊を3回試行したところ22個/実験のカルボキシン耐性株を得ることができたが、HR体は含まれていなかった。これによりシイタケにおいても他の真正担子菌綱の菌類と同様にHRよりもNHEJが優先的に起こることが示された。次に、pyrG遺伝子を切断するように調製したCRISPR/Cas9カセットを持つCas9ベクターとの共導入実験を行った。3回の試行で36個/実験のカルボキシン耐性株を得ることができた。このうち7株についてはHRによるシイタケpyrG遺伝子の破壊が確認された。Cas9遺伝子配列のゲノムPCRを行ったところ、7株中5株については増幅が確認できなかった。得られたΔpyrG株を宿主としてシイタケpyrG遺伝子の導入を2回繰り返したところ、平均6個/実験の原栄養体を得ることができた。これにより新規選択マーカー遺伝子としてもシイタケpyrG遺伝子を利用できることが示された。

为了开发一种不涉及平菇重组的基因修饰系统，我们尝试通过暂时引入CRISPR/Cas9表达盒基因来破坏目标基因。结果，我们获得了多个目标基因被破坏的菌株，其中许多不包含Cas9基因。因此，我们能够开发出一种技术，该技术将导致非重组基因修饰系统的开发，与 RNP 不同，该系统可以使用选择性标记基因快速选择基因组编辑菌株。香菇是一种可食用的担子菌，在日本比平菇更有名。据 Tanemura 等人介绍，预计对植物源性饲料具有较高的性能改善效果（Tanemura 等人 Aquaculture 2016；453：130-134）。然而，基因工程实验方法的发展比平菇还要慢，而且还没有基因打靶的成功例子，而基因打靶对于基因功能分析至关重要。当我们尝试仅使用供体载体通过同源重组（HR）破坏香菇pyrG基因3次时，我们每次实验都能获得22个耐羧酶菌株，但不包括HR形式。这表明 NHEJ 在香菇中优先于 HR 发生，就像在其他真担子菌门真菌中一样。接下来，我们用含有 CRISPR/Cas9 盒的 Cas9 载体进行了共引入实验，该载体准备用于切割 PyrG 基因。我们在三项试验中每次实验获得了 36 株耐羧菌素菌株。在其中 7 个菌株中，证实了 HR 破坏了香菇pyrG 基因。当我们对 Cas9 基因序列进行基因组 PCR 时，7 个菌株中有 5 个无法确认扩增。当使用所得的ΔpyrG菌株作为宿主两次引入香菇pyrG基因时，我们能够在每次实验中平均获得6个原养菌。这表明香菇pyrG基因也可以用作新的选择标记基因。

项目成果

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专利数量（0）

Marker-free genome editing in the edible mushroom, Pleurotus ostreatus, using transient expression of genes required for CRISPR/Cas9 and for selection

使用 CRISPR/Cas9 和选择所需基因的瞬时表达，对食用菌平菇进行无标记基因组编辑

DOI：
10.1186/s10086-022-02033-6
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
2.9
作者：
Koshi Daishiro;Ueshima Hiroki;Kawauchi Moriyuki;Nakazawa Takehito;Sakamoto Masahiro;Hirata Mana;Izumitsu Kosuke;Sumita Takuya;Irie Toshikazu;Honda Yoichi
通讯作者：
Honda Yoichi

ヒラタケにおけるPKAcホモログの機能

平菇中 PKAc 同系物的功能