浸透圧ストレスを克服できる生物に幅広く存在する新規なタンパク質の正体の解明と応用

广泛存在于生物体中可克服渗透压的新型蛋白质的阐明和应用

• 批准号: 22K05442
• 负责人: 福田 庸太
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05442/
• 关键词: 乾燥耐性; 結晶構造解析; 構造生物化学; 浸透圧ストレス; 酸化ストレス

本研究の目的は、浸透圧ストレスを克服できる生物に幅広く存在する新規なタンパク質の構造と機能をつまびらかにし、浸透圧ストレス耐性の分子基盤に関する知見を得ることである。本年度は、厳しい乾燥に耐える動物や植物、極限環境耐性を持つ生物が共通して有していながら構造及び機能が未知であるタンパク質Aの解析をこころみた。タンパク質Aは、構造が既知のタンパク質との配列相同性を示さないいっぽうで、多様なドメイン・界の生物にホモログが見つかることがわかっており、とりわけ乾燥に強いとされる動物や植物に存在している。本研究ではまず高い乾燥耐性能を持つクマムシ由来のタンパク質を、大腸菌を用いて組換え体タンパク質として生産し、これを高純度精製した後にX線結晶構造解析を用いて立体構造を決定した。得られた立体構造から、タンパク質Aは金属結合部位を有していることが明らかになった。また、金属原子からの異常散乱を利用し、この金属が亜鉛であることを突き止めた。タンパク質内部に亜鉛結合部位を持つこと、分子表面から亜鉛結合部位までトンネル状構造があることなどから、本タンパク質が何らかの酵素であるという仮説を立てた。仮説に基づき、脱リン酸化活性を測定したところ、本タンパク質が幅広い基質に対して脱リン酸化活性を持つことが明らかになった。活性中心周囲のアミノ酸に変異を導入した変異体タンパク質も精製し、その活性についても検討した。また、本タンパク質をHEK293細胞に導入し、その細胞内局在を調べたところ、細胞内の様々な部位に存在しうることが明らかになった。なお、本タンパク質の菌類由来ホモログは小胞体に局在すると報告されていたが、クマムシ由来タンパク質は（少なくともヒト細胞で発現させた際には）小胞体上には観察されなかった。

本研究的目的是揭示生物体中广泛存在的能够克服渗透胁迫的新型蛋白质的结构和功能，并获得有关渗透胁迫耐受性的分子基础的知识。今年，我们的目标是分析蛋白质A，它是能够承受严重干旱的动植物以及能够耐受极端环境的生物体所共有的，但其结构和功能尚不清楚。尽管蛋白质 A 与已知结构的蛋白质没有序列同源性，但已知蛋白质 A 的同源物存在于不同领域和界的生物体中，特别是在据说具有抗旱性的动物和植物中发现。在这项研究中，我们首先利用大肠杆菌生产了一种具有高干燥耐受性的水熊虫衍生蛋白作为重组蛋白，将其纯化至高纯度，​​然后使用X射线晶体学测定了其三维结构。获得的三维结构表明蛋白质A具有金属结合位点。利用金属原子的异常散射，他们还确定这种金属是锌。基于该蛋白质内部有一个锌结合位点，并且从分子表面到锌结合位点有一个隧道状结构，我们推测该蛋白质是某种酶。根据我们的假设，我们测量了去磷酸化活性，发现该蛋白质对多种底物具有去磷酸化活性。还纯化了在活性中心周围的氨基酸中引入突变的突变蛋白，并研究了其活性。此外，当将该蛋白引入HEK293细胞并研究其细胞内定位时，发现它可以存在于细胞内的多个位点。尽管据报道该蛋白的真菌同源物定位在内质网中，但在内质网上并未观察到缓步动物蛋白（至少当在人类细胞中表达时）。

项目成果

A new enzyme from tardigrades

来自缓步动物的新酶

• 发表时间: 2022
• 作者: 〇Subaru Kato; Yohta Fukuda; Tsuyoshi Inoue
• 通讯作者: Tsuyoshi Inoue