活性酸素種を量産する細胞質フラビン酵素が酸素に応答する現象・機構の解明

阐明大量产生活性氧的细胞质黄素酶对氧的反应现象和机制

基本信息

批准号：
22K05436
负责人：
荒川孝俊
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、ニンニクのクラスB型フラビン含有酸素添加酵素（BFMO）であるAsFMO1について生化学・生物生産・構造解析の諸実験を行ってBFMO活性を調節する因子を探し出すこと、触媒サイクルにおける複雑な中間状態を調査することを課題としている。本年度は酵素主反応であるアリイン生成活性、ならびにAsFMO1の活性発揮機序の探索を目的とする以下の実験を行った。１.アリイン合成を変動させる手段の探索に対しては、基質S-アリルシステインを添加してAsFMO1発現大腸菌を培養した細胞抽出液におけるアリインを調査した。酵素アリイナーゼ添加に応じたアリイン代謝物の検出は極微量であり、細胞内因子によるアリイン生成増強は観測されなかった。加えて、AsFMO1やAsFMO1とヒト肝臓ミクロソームで機能する哺乳類祖先型フラビンモノオキシゲナーゼAncFMO2を精製し、精製酵素に対して反応溶液中の溶存酸素濃度変化を電気化学測定により追跡した。その結果、NADPH添加に応じた酸素消費速度の増減は認められなかった。また、同一条件下でのNADPH消費活性と過酸化水素生成を呈色反応で計測したところ、AncFMO2のNADPH酸化能力はAsFMO1の約半分であり、AsFMO1, AncFMO2がNADPHの還元力を過酸化水素生成に転換する効率は20-25%程度であること、AncFMO2の活性酸素の生成能力はAsFMO1に対して40%程度であることがわかった。２.AsFMO1の活性発揮機序の探索に対しては、過酸化水素を含有させた反応液のAsFMO1反応時の過酸化水素濃度変化を計測した。生成／消費速度に変化はみられなかったことからAsFMO1はペルオキシダーゼ活性をもたず、過酸化水素を酸素から生成する方向にのみ触媒することが示された。

在本研究中，我们对来自大蒜的B类黄素加氧酶（BFMO）AsFMO1进行了各种生化、生物生产和结构分析实验，以寻找调节BFMO活性的因素，并鉴定调节复合物的因素催化循环的任务是研究中间状态。今年，我们进行了以下实验，旨在探索主要酶促反应蒜氨酸的产生活性以及AsFMO1发挥其活性的机制。 1. 为了寻找改变蒜氨酸合成的方法，我们研究了通过培养表达 AsFMO1 的大肠杆菌并添加底物 S-烯丙基半胱氨酸获得的细胞提取物中的蒜氨酸。响应添加蒜氨酸酶而检测到的蒜氨酸代谢物的量极少，并且没有观察到细胞内因子增强蒜氨酸的产生。此外，我们纯化了 AsFMO1 和 AncFMO2（一种与 AsFMO1 和人肝微粒体一起发挥作用的祖先哺乳动物黄素单加氧酶），并通过电化学测量监测纯化酶反应溶液中溶解氧浓度的变化。结果，没有观察到氧消耗率因添加NADPH而增加或减少。此外，当我们使用显色反应测量相同条件下的NADPH消耗活性和过氧化氢产生时，我们发现AncFMO2的NADPH氧化能力约为AsFMO1的一半，并且AsFMO1和AncFMO2具有还原NADPH和过氧化氢的能力。结果发现，AncFMO2 转化为 AsFMO2 的效率约为 20-25%，AncFMO2 产生活性氧的能力约为 AsFMO1 的 40%。 2. 为了探究AsFMO1发挥活性的机制，我们在含有过氧化氢的反应溶液中测量了AsFMO1反应过程中过氧化氢浓度的变化。没有观察到生产/消耗速率的变化，表明AsFMO1不具有过氧化物酶活性，仅催化氧气产生过氧化氢。