オルガネラ間相互作用による出芽酵母液胞膜イオンチャネルの活性化機構の研究

通过细胞器间相互作用研究出芽酵母液泡膜离子通道的激活机制

基本信息

批准号：
22K05425
负责人：
浜本晋
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

TRPチャネルは、環境変化に応答する陽イオンチャネルとして多くの真核生物に保存されている。出芽酵母のホモログであるTRPY1は液胞膜に発現して細胞外の浸透圧変化に応答して液胞から細胞質にCa2+を放出しているが、その浸透圧変化を感知する分子機構は不明である。本研究では、TRPY1による高浸透圧応答に関わる制御因子の同定を目的に、出芽酵母の一遺伝子破壊株コレクション5100株にイクオリン遺伝子を導入してCa2+の発光検出を行った。その結果、43株において高浸透圧ストレス応答に変化が観察された。さらに、43株において破壊されている遺伝子を野生株よりクローニングし、出芽酵母に過剰発現させたところ、7つの遺伝子発現株において野生株よりも高い高浸透圧応答活性が示された。本研究では、イクオリンアッセイによる細胞内Ca2+の検出、タンパク質相互作用、電気生理学的解析手法の一つであるパッチクランプ法を用いてTRPY1のイオンチャネル活性の測定を行い、これらの候補制御因子によるTRPY1の活性制御機構の解明を目指す。多くのオルガネラはサイズが小さいことからパッチクランプ法の適用が難しい。そのため、オルガネラ膜局在性イオンチャネルの研究は遅れている。出芽酵母の液胞は比較的大きいことからパッチクランプ法の適用が可能であり、これまでに幾つかのイオンチャネル活性の測定に成功している。本研究では、オルガネラ膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に局在化させるシグナル配列の開発を行い、出芽酵母液胞膜を用いた機能解析系の構築を目指している。前年度までに見出したシグナル配列（X18タグ）の付加により、チラコイド膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に発現させることに成功しているが、未だ多くのイオン輸送体においては液胞膜への局在化が達成されていない。本年度以降の研究においてシグナル配列の改良を行う。

TRP 通道在许多真核生物中是保守的，作为响应环境变化的阳离子通道。 TRPY1 是酿酒酵母的同源物，在液泡膜中表达，并响应细胞外渗透压的变化将 Ca2+ 从液泡释放到细胞质中，但其感知渗透压变化的分子机制尚不清楚。在这项研究中，我们将水母发光蛋白基因引入5100个单基因破坏的酿酒酵母菌株中，并检测Ca2+的发光，目的是鉴定参与TRPY1诱导的高渗透压反应的调节因子。结果，在 43 个菌株中观察到高渗应激反应的变化。此外，当从野生菌株中克隆菌株43中被破坏的基因并在酿酒酵母中过表达时，七种基因表达菌株表现出比野生菌株更高的高渗反应活性。在本研究中，我们使用水母发光蛋白测定法检测细胞内Ca2+，测量蛋白质相互作用，并使用膜片钳法测量TRPY1的离子通道活性，这是一种电生理分析方法，旨在阐明活性控制机制。许多细胞器由于尺寸小而难以应用膜片钳技术。因此，细胞器膜定位离子通道的研究被推迟。由于酿酒酵母的液泡较大，可以采用膜片钳方法，目前已成功测量了多种离子通道活性。在本研究中，我们的目标是开发将细胞器膜定位离子通道定位到酿酒酵母液泡膜的信号序列，并利用酿酒酵母液泡膜构建功能分析系统。尽管我们通过添加前一年发现的信号序列（X18标签），成功在酿酒酵母的液泡膜中表达了类囊体膜定位的离子通道，但许多离子转运蛋白仍然没有实现液泡膜定位。。从今年开始，我们将在研究中改进信号序列。