酢酸菌PQQ酵素の指向性進化と「ゆるい」基質特異性の理解

了解醋杆菌 PQQ 酶的定向进化和“松散”底物特异性

• 批准号: 22K05383
• 负责人: 阿野 嘉孝
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05383/
• 关键词: PQQ酵素; 酢酸菌; 酵素; グリセロール脱水素酵素

酢酸菌においてピロロキノリンキノン（PQQ)を補欠分子族とするPQQ酵素は、産業的な物質生産の中心的役割を担う重要な酵素群であり「ゆるい」基質特異性を示すことが特徴的である。このゆるい基質特異性に起因して新しく発見される酵素反応は、持続可能社会のための新たな微生物変換技術の創出にもつながることから注目されている。本研究では、このゆるい基質特異性の構造学的理解を深めるために、その障害となっていた酵素安定性の向上、さらには物質生産性の向上を目指して、進化指向的変異導入法を確立して優良変異体を獲得することを目的とし、得られた変異体酵素を用いて基礎研究および応用研究を深めることにある。１年目となる今年度は、酢酸菌PQQ依存性グリセロール脱水素酵素（GLDH）の変異体取得に注力した。申請者の考案した「酢酸菌直接形質転換選抜法」を実施して各工程の最適化を図り、得られた変異体の性能価を進めた。また、ゲノムシャッフリングによる多重変異導入法の条件も確立し、GLDHの「指向性変異法」の確立に向けて大きな進展を得た。変異酵素の性能評価を実施した結果、獲得した変異体は負の影響をもたらすものが多く、期待する機能が向上した変異体取得に向けて継続した変異導入が必要であると判断した。その中で、２株の酵素活性の安定化に繋がる変異体の取得に成功し、変異体酵素の性能を評価するとともに、発酵生産性への影響を調査しているところである。２年目以降は、これまでの継続した変異体取得に加えて、獲得した２株の優良変異体の性能評価、さらには多重変異の導入によりGLDHの指向性変異を進め、ゆるい基質得意性に関する知見を深めていく予定である。

在乙酸菌中，以吡咯喹啉醌（PQQ）为辅基的 PQQ 酶是在工业物质生产中发挥核心作用的重要酶类，其特点是表现出“松散”的底物特异性。由于这种松散的底物特异性而新发现的酶反应引起了人们的关注，因为它们可能会为可持续社会创造新的微生物转化技术。在本研究中，为了加深我们对这种松散底物特异性的结构理解，我们建立了一种进化导向的突变引入方法，目的是提高一直是障碍的酶稳定性，并进一步提高材料生产率。研究的目的是获得优良的突变酶，并利用获得的突变酶深化基础和应用研究。今年，第一年，我们重点获得了醋酸菌PQQ依赖性甘油脱氢酶（GLDH）的突变体。我们实施了申请人设计的“醋酸菌直接转化选择方法”，优化了各个步骤，提高了所得突变体的性能值。我们还建立了使用基因组改组的多重诱变方法的条件，并在建立 GLDH 的“定向诱变方法”方面取得了重大进展。评价突变体酶的性能的结果是，获得的许多突变体具有负面影响，并且确定需要连续引入突变才能获得具有预期改进功能的突变体。在这些努力中，我们已经成功获得了稳定两种菌株酶活性的突变体，目前正在评估突变体酶的性能并研究它们对发酵生产率的影响。从第二年开始，我们除了继续获得突变体外，还将评估我们获得的两个优良突变体的性能，并通过引入多个突变来进一步推进GLDH的定向突变，以提高其松散底物偏好性。我们的知识。

项目成果

Histamine elimination by a coupling reaction of fungal amine oxidase and bacterial aldehyde oxidase

通过真菌胺氧化酶和细菌醛氧化酶的偶联反应消除组胺

• DOI: 10.1093/bbb/zbac121
• 发表时间: 2022
• 作者: Masakatsu Usui; Hikari Kubota; Mizuki Ishihara; Haruka Matsuki; Shinya Kawabe; Yoshimasa Sugiura; Naoya Kataoka;Kazunobu Matsushita; Yoshitaka Ano; Yoshihiko Akakabe; Roque A. Hours; Toshiharu Yakushi; Osao Adachi
• 通讯作者: Osao Adachi

Development of efficient 5-ketogluconate production system by Gluconobacter japonicus

日本葡萄糖酸杆菌高效生产5-酮葡萄糖酸系统的开发

• DOI: 10.1007/s00253-022-12242-0
• 发表时间: 2022
• 作者: Kataoka N; Naoki K; Ano Y; Matsushita K; Yakushi T.
• 通讯作者: Yakushi T.

Periplasmic dehydroshikimate dehydratase combined with quinate oxidation in Gluconobacter oxydans for protocatechuate production

氧化葡糖杆菌中周质脱氢莽草酸脱水酶与奎宁酸氧化相结合用于原儿茶酸生产

• DOI: 10.1093/bbb/zbac090
• 发表时间: 2022
• 作者: Nagaki K; Kataoka N; Theeragool G; Matsutani M; Ano Y; Matsushita K; Yakushi T.
• 通讯作者: Yakushi T.