ゲノム編集技術を駆使して特異な非モデル藍藻の遠赤色光への適応機構を解明する

利用基因组编辑技术阐明独特的非模型蓝藻对远红光的适应机制

基本信息

批准号：
22K05381
负责人：
土屋徹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

昨年度までに開発に成功したAcaryochloris marinaでのゲノム編集関連技術について、CRISPR干渉による遺伝子機能の解析とゲノム編集の効率化を目的として研究を進めた。CRISPR干渉では、標的遺伝子の発現を抑制することで表現型から遺伝子の機能を解析することができる。そこで、本研究課題であるクロロフィルd生合成に関与する酵素の遺伝子を探求するために、候補遺伝子のノックダウンを開始した。昨年度までに、発現抑制の程度の異なるいくつかのCRISPR干渉ベクターを開発していたので、それらを用いて標的遺伝子のノックダウンを試みたが、予想される表現型を示す形質転換株は得られなかった。コントロールとして並行して進めている既知の光合成関連遺伝子のノックダウンの試みでは期待される表現型が得られない場合もあったため、現時点では検証した遺伝子がクロロフィルd生合成に関与するかどうかは判別できない。候補となる遺伝子は他にも数多くあるので、それらのなかに目的の遺伝子がある可能性も考慮して、さらにCRISPR干渉による解析を進める必要がある。このようにCRISPR干渉の限界が明らかになってきたため、解析を促進するためにゲノム編集の効率化が必要とされた。これまでに成功していたゲノム編集の実験系では時間や労力が多くかかるため、多くの標的遺伝子の破壊を同時に進めることが難しかった。そこで、ベクターの改変などを検討することでゲノム編集の効率化を図った。その結果、A. marinaでゲノム編集をおこなう際に検討する必要がある条件についての知見が得られた。この結果より、CRISPR干渉では表現型が現れない遺伝子については、ゲノム編集による遺伝子破壊で機能を特定できる考えられた。

对于我们去年成功开发的Acaryocholis marina基因组编辑相关技术，我们进行了研究，目的是通过CRISPR干扰分析基因功能，提高基因组编辑的效率。通过CRISPR干扰，可以通过抑制靶基因的表达，从表型上分析基因功能。因此，为了探索参与叶绿素d生物合成的酶基因（本研究的主题），我们开始敲除候选基因。直到去年，我们已经开发了几种具有不同程度表达抑制的CRISPR干扰载体，并试图用它们来敲低目标基因，但我们无法获得表现出预期表型的转化体。作为对照同时进行的敲除已知光合作用相关基因的尝试有时不会产生预期的表型，因此目前仍有待确定测试的基因是否参与叶绿素 d 生物合成。不能。其他候选基因还有很多，需要考虑目标基因是否在其中，并利用CRISPR干扰进行进一步分析。随着 CRISPR 干扰的局限性变得清晰，需要提高基因组编辑的效率以方便分析。此前成功的基因组编辑实验系统需要花费大量的时间和精力，因此很难同时破坏许多目标基因。因此，他们试图通过考虑载体修饰来提高基因组编辑的效率。因此，我们了解了在 A. marina 中进行基因组编辑时需要考虑的条件。这些结果表明，对于没有受到CRISPR干扰而出现表型的基因，可以通过基因组编辑破坏它们来鉴定其功能。