インスリン分解酵素の活性分離に及ぼすチロシン修飾の影響

酪氨酸修饰对胰岛素降解酶活性分离的影响

• 批准号: 22K05343
• 负责人: 幡川 祐資
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05343/
• 关键词: インスリン分解酵素; チロシン残基; Cookson型試薬; タンパク質ラベル化; 阻害剤; アミロイドβ; インスリン

インスリン分解酵素 (IDE) は、インスリン (Ins) のみならず、アミロイドβ (Aβ) も分解する。そのためIDEは、2型糖尿病のリスク上昇と、アルツハイマー病のリスク軽減の二面性を有する。一方IDEによる分解は、活性中心のactive siteと基質結合部位のexo siteが関与する。また、active siteとexo siteに2個のチロシン残基 (Tyr) が存在するため、これらの修飾を介し、Ins分解の抑制とAβ分解の亢進など、好ましい基質特異性の改変も期待される。そこでTyrとのEne反応が知られるCookson試薬 (4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione, PTAD) を用い、IDEのTyr修飾による基質特異性・分解活性への影響評価を目的とした。PTAD修飾をしたIDE (PTAD-IDE) をtrypsin、V8およびchymotrypsinで処理し、LC-MS(/MS)により測定した結果、配列カバー率は89.97%であった。IDEに存在するTyr残基43個のうち15個の修飾が確認され、鍵となるactive siteとexo siteのTyrの修飾も同定された。またIDEが1日でAβとInsの両者を99%以上分解したのに対し、PTAD-IDEは3日でAβのみを99%以上分解し、Insの分解は見られなかった。更に、AβおよびInsが共存している試料内でも、同様の活性分離が確認された。ちなみにIDEのTyr314/Tyr831の複合体における基質との距離は、AβのGlu3/Phe19と各々10.6 Å/2.9 Å、InsのHis10/Phe1と各々2.8 Å/3.7 Åである事から、Tyr314/Tyr831両者からの結合距離の短いInsがより修飾の影響を受け、活性が阻害されたと推測した。

胰岛素降解酶 (IDE) 不仅降解胰岛素 (Ins)，还降解β淀粉样蛋白 (Aβ)。因此，IDE具有增加2型糖尿病风险和降低阿尔茨海默病风险的双重作用。另一方面，IDE 降解涉及活性中心的活性位点和底物结合位点的外切位点。此外，由于活性位点和外切位点中有两个酪氨酸残基（Tyr），因此通过这些修饰预计底物特异性会发生有利的变化，例如抑制Ins降解和增强Aβ降解。因此，我们使用已知与Tyr反应的Cookson试剂（4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮，PTAD）来评估IDE的Tyr修饰对底物特异性和分解的影响活动的目的是。将PTAD修饰的IDE(PTAD-IDE)用胰蛋白酶、V8和胰凝乳蛋白酶处理，并且作为通过LC-MS(/MS)测量的结果，序列覆盖率为89.97％。确认了 IDE 中存在的 43 个 Tyr 残基中的 15 个的修饰，并且还鉴定了关键活性位点和外切位点的 Tyr 修饰。此外，IDE 在 1 天内降解了 99% 以上的 Aβ 和 Ins，而 PTAD-IDE 在 3 天内仅降解了 99% 以上的 Aβ，并且没有观察到 Ins 的降解。此外，在 Aβ 和 Ins 共存的样品中也证实了类似的活性分离。顺便提及，IDE的Tyr314/Tyr831复合物中到底物的距离对于Aβ的Glu3/Phe19分别为10.6 Å/2.9 Å，对于Ins的His10/Phe1分别为2.8 Å/3.7 Å。 Å，推测与Tyr314/Tyr831结合距离较短的Ins受修饰影响较大，其活性受到抑制。

项目成果

インスリン分解酵素の基質特異性に及ぼすチロシン修飾の影響

酪氨酸修饰对胰岛素降解酶底物特异性的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: 竹内裕貴; 幡川祐資; 李 宣和; 大江知行
• 通讯作者: 大江知行

Cookson型蛍光試薬によるTyr残基のラベルとその蛍光特性に関する基礎的検討

Cookson型荧光试剂标记Tyr残基及其荧光性质的基础研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 野尻ことね; 幡川祐資; 李 宣和; 大江知行
• 通讯作者: 大江知行