in-cell 高感度一分子構造ダイナミクス解析システムの開発

细胞内高灵敏度单分子结构动力学分析系统的开发

• 批准号: 22K05018
• 负责人: 坂口 美幸
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Saitama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05018/
• 关键词: 細胞内分光計測; 蛍光相関分光法; 生体高分子; 蛍光寿命相関分光法; 細胞内計測; 構造ダイナミクス

細胞内では、核酸やタンパク質、脂質などの生体高分子が混雑して存在し、互いに相互作用する中でその機能を発現している。一分子分解能で計測したデータから得られる生体高分子の構造ダイナミクスは分子物性を反映するが，これまでほとんどの研究はin vitroにおいて為されてきた．本研究では，細胞内環境において生体高分子の詳細な物性解析を可能にする，高感度の一分子計測システムの開発を目指す．この目的のもと，in vitroにおいてマイクロ秒の高い時間分解能で構造不均一性を検出することが既に報告されている二次元蛍光光寿命相関分光法を，細胞内計測に応用する．初年度は新たに細胞実験を行う環境を構築する必要があった．そこで，細胞を取り扱っている研究室で培養方法を学んで情報を収集し，必要な装置や消耗品を購入し準備を進めた．また細胞へ導入する予定の生体高分子である蛍光色素標識したDNA鎖を入手し，予め二次元蛍光寿命相関分光法によりin vitroにおいて構造ダイナミクスの解析を行った．二次元蛍光光寿命相関分光法を行うための蛍光寿命相関分光装置は，in vitroの系で最適化されていたため，細胞内計測に応用するための改良を行った．また蛍光タンパク質を導入した細胞を入手し改良した装置で計測することで，細胞内計測における問題点を調査した．その結果，蛍光タンパク質以外のバックグラウンドに由来する信号が見られたため，これを除去する解析法の検討を行った．尚，初年度は８月末から３月末までの間産後休暇及び育児休暇を取得したため，その間研究は中断した．

在细胞内部，核酸、蛋白质和脂质等生物聚合物以拥挤的方式存在，它们的功能通过它们之间的相互作用而表达。从单分子分辨率测量的数据获得的生物聚合物的结构动力学反映了分子特性，但大多数研究都是在体外进行的。在这项研究中，我们的目标是开发一种高灵敏度的单分子测量系统，能够对细胞内环境中的生物聚合物进行详细的物理性质分析。为此，我们将应用二维荧光寿命相关光谱法进行细胞内测量，据报道，二维荧光寿命相关光谱法可以在体外以微秒级时间分辨率检测结构异质性。第一年，需要创造一个新的环境来进行细胞实验。因此，我在处理细胞的实验室学习了如何培养细胞，收集信息，并购买必要的设备和消耗品进行准备。我们还获得了荧光染料标记的 DNA 链，这是一种被引入细胞的生物聚合物，并使用二维荧光寿命相关光谱分析了其体外结构动力学。用于执行二维荧光寿命相关光谱的荧光寿命相关光谱仪已经在体外系统中进行了优化，因此我们对其进行了改进以应用于细胞内测量。我们还通过获取已引入荧光蛋白的细胞并使用改进的设备对其进行测量来研究细胞内测量中的问题。结果，观察到来自荧光蛋白以外的背景的信号，因此我们研究了消除这种信号的分析方法。第一年，我从八月底到三月底休产后假和育儿假，所以那段时间我的研究就中断了。