Dynamic higher-order conformational changes control the fluorescence lifetime of fluorescent proteins

动态高阶构象变化控制荧光蛋白的荧光寿命

• 批准号: 22K05027
• 负责人: 細井 晴子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05027/
• 关键词: 黄色蛍光タンパク質; 緑色蛍光タンパク質; 発光メカニズム; 蛍光寿命; 会合; 構造緩和; 蛍光共鳴エネルギー移動; 蛍光タンパク質; 時間分解蛍光分光法; 蛍光異方性; 高次構造ダイナミクス

研究代表者は、すべての蛍光タンパク質に共通する発光メカニズム解明を目指している。本研究では、黄色蛍光タンパク質eYFPでは145番アミノ酸一つが変化するだけで蛍光寿命が大きく変化するが、非常によく似た緑色蛍光タンパク質eGFP（アミノ酸の相同性98%）ではあまり変化しないことに注目する。この事実は、通常説明されるような発色団周辺の水素結合ネットワークなどの局所構造の違いだけでは説明できない。研究代表者は、蛍光タンパク質の会合とピコ秒、ナノ秒のタイムスケールで起こるダイナミックな高次構造変化が、蛍光寿命を変化させていると考えている。本課題では、ピコ秒時間分解蛍光異方性測定により、最もイメージングに用いられるeYFPとeGFPの発光メカニズム、ダイナミックな高次構造変化、 および、発色団周辺の局所的な構造変化の相関を明らかにする。すでに、eYFP野生型の発光メカニズムにおいて、会合が大きな影響を与えていることを明らかにしている。これまでに、eYFP Y145変異体のピコ秒時間分解蛍光異方性測定が終了している。その結果、１４５番アミノ酸一つの違いで、異方性が大きく変化することが明らかになった。また、対応するA206K変異体についても測定を行った。A206K変異は、eYFPの会合を抑制する効果をもつ。すべてのA206K変異体の異方性の時間変化が典型的な蛍光タンパク質単量体の挙動を示したことから、eYFP Y145変異体の大きな変化は、会合に由来することが明らかになった。また、eGFP野生型の異方性の時間変化は、典型的な蛍光タンパク質単量体の挙動に近いことが分かった。つまり、eGFP野生型では、あまり会合が起きていないことを意味する。eYFP野生型とeGFP野生型の寿命はいずれも長いが、その会合状態は異なることが明らかになった。

主要研究人员旨在阐明所有荧光蛋白共有的发光机制。在这项研究中，我们关注的事实是，在黄色荧光蛋白 eYFP 中，仅第 145 位氨基酸的一个变化就显着改变了荧光寿命，但在非常相似的绿色荧光蛋白 eGFP 中（98% 氨基酸同源性） ，变化不大。这一事实不能仅仅通过局部结构的差异来解释，例如发色团周围的氢键网络，正如通常所解释的那样。主要研究人员认为，荧光蛋白与皮秒至纳秒时间尺度上发生的动态构象变化的关联会改变荧光寿命。在本项目中，我们将利用皮秒时间分辨荧光各向异性测量来阐明最常用于成像的eYFP和eGFP的发射机制、它们的动态高阶结构变化以及发色团周围局部结构变化之间的相关性。做。我们已经表明关联对 eYFP 野生型的发光机制有重大影响。迄今为止，eYFP Y145突变体的皮秒时间分辨荧光各向异性测量已经完成。结果表明，145位氨基酸的单一差异显着改变了各向异性。我们还测量了相应的 A206K 突变体。 A206K突变具有抑制eYFP关联的作用。所有A206K突变体各向异性的时间变化均表现出典型的荧光蛋白单体行为，表明eYFP Y145突变体的较大变化是由于关联所致。我们还发现野生型 eGFP 各向异性的时间变化与典型荧光蛋白单体的行为接近。这意味着 eGFP 野生型中几乎没有发生关联。结果表明，eYFP野生型和eGFP野生型都具有较长的寿命，但它们的结合状态不同。