ロングリードシークエンスを用いた混合ゲノム試料解析の探索的研究

使用长读长测序进行混合基因组样本分析的探索性研究

• 批准号: 21K19675
• 负责人: 奥田 貴久
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19675/
• 关键词: ロングリードシークエンサー; ナノポアテクノロジー; 個人識別

第3世代シークエンサー(MinION)の予備試験としてλ-DNAを用いたサンプル調整、ライブラリーの作製、テスト分析を実施した。これにより、MinIONの操作方法や分析法における原理について理解を深めた。血液試料からDNA Mini Kit(キアゲン)を使用してDNA抽出及び定量を行い十分なDNA量が存在していることを確認した。その抽出したDNAからミトコンドリアDNAを選択的に取得するために、エクソヌクレアーゼV処理とエタ沈によりゲノムDNAを除去した。MinIONによるシークエンスの際の参照配列を得るためにミトコンドリアDNA全塩基配列(16kbp)を用いてサンガー法でシークエンスを試みた。今回我々は、ミトコンドリアDNAの全塩基配列をカバーするために、プライマーを21セット、さらに確認のため6セットを追加し、作製した。この結果、本実験の参照配列としての正確なミトコンドリアDNA全配列が得られた。ヒトDNAを用いてロングPCRを実施し、そのPCR産物をMinIONでロングリードのシークエンスを行った。MinIONによるシーケンス後、読み取られた塩基配列を含むfastqファイルの品質チェックは、FastQCを用いて行った。FastQCから得られたレポートにより、シーケンスが正しく行われていることを確認した。次に、fastqファイルのデータはminimap2を用いて参照配列にマッピングを行った。マッピングされたデータは、BAM形式で保存し、必要に応じてクオリティフィルタリングを実行した。その結果、ミトコンドリアDNAの全塩基数が38kbp前後と長く検出されたため、プライマーを２セット再設定したが、いずれも38kbpであったため、再考する必要がある。

作为第三代测序仪（MinION）的初步测试，我们使用λ-DNA进行了样品制备、文库制备和测试分析。通过这次活动，我们加深了对MinION操作方法和分析方法原理的理解。使用DNA Mini Kit(Qiagen)从血样中提取DNA并进行定量，并确认存在足够量的DNA。为了从提取的DNA中选择性地获得线粒体DNA，通过核酸外切酶V处理和ETase沉淀去除基因组DNA。为了获得 MinION 测序的参考序列，我们尝试使用整个线粒体 DNA 序列 (16 kbp) 使用 Sanger 方法进行测序。这次，我们创建了 21 组引物来覆盖线粒体 DNA 的整个碱基序列，并另外创建了 6 组用于确认。结果，获得了准确的完整线粒体DNA序列作为本实验的参考序列。使用人类 DNA 进行长 PCR，并使用 MinION 对 PCR 产物进行长读长测序。使用 MinION 测序后，使用 FastQC 检查包含读碱基序列的 fastq 文件的质量。从 FastQC 获得的报告证实测序正确进行。接下来，使用 minimap2 将 fastq 文件数据映射到参考序列。映射的数据以 BAM 格式保存，并根据需要执行质量过滤。结果检测到线粒体DNA的碱基总数很长，在38kbp左右，于是重新设置了两组引物，但由于都是38kbp，所以需要重新考虑。

项目成果

日本大学医学部社会医学系法医学分野ホームページ

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Role of miR-143 and miR-146 in Risk Evaluation of Coronary Artery Diseases in Autopsied Samples

miR-143 和 miR-146 在尸检样本中冠状动脉疾病风险评估中的作用

• DOI: 10.3390/genes14020471
• 发表时间: 2023
• 影响因子: 3.5
• 作者: Tie Jian;Takanari Hiroki;Ota Koya;Okuda Takahisa
• 通讯作者: Okuda Takahisa

Detection of deletion/insertion polymorphism profiles from single human hair shafts.

检测单个人类发干的缺失/插入多态性谱。

• DOI: 10.1007/s11033-021-06921-w
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 2.8
• 作者: Tie J; Uchigasaki S; Isobe E; Iwakami E; Okuda T:
• 通讯作者: Okuda T:

口腔内液(唾液)中DNAに関する研究(第2報).

口腔液（唾液）中 DNA 的研究（第二次报告）。

• 发表时间: 2021
• 作者: 千葉 正悦; 呂 彩子; 向井 敏二; 早田 詩織; 飯酒盃 勇; 鉄 堅; 磯部 英二; 内ヶ崎 西作; 奥田 貴久
• 通讯作者: 奥田 貴久

Sudden death of a child associated with invasive non-typeable Haemophilus influenzae infection with underlying IgG2 subclass deficiency

一名儿童突然死亡，与具有潜在 IgG2 亚类缺陷的侵袭性不可分型流感嗜血杆菌感染相关

• DOI: 10.1016/j.legalmed.2023.102240
• 发表时间: 2023
• 影响因子: 1.5
• 作者: Abe Yuriko;Takano Chika;Tie Jian;Isobe Eiji;Ohirabaru Ayumi;Isahai Isamu;Nishiyama Hiroyuki;Jike Toyoharu;Masuda Shinobu;Okuda Takahisa
• 通讯作者: Okuda Takahisa