膜タンパク質超集積化のための無細胞固相合成システムの開発

膜蛋白超整合无细胞固相合成系统的开发

基本信息

批准号：
21K18324
负责人：
佐々木善浩
金额：
$ 16.56万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K18324/
关键词：
膜タンパク質無細胞蛋白質合成固相合成法人工細胞

项目摘要

全タンパク質の半数以上を占める膜タンパク質の人工合成法の開発は、基礎生物学、医学、薬学において極めて重要であるが、膜タンパク質の簡便な合成は未だ不可能である。本研究では、この膜タンパク質を固相システムにより大量合成する未踏科学技術に挑戦する。従来、膜タンパク質は、大腸菌などで過剰発現させ、界面活性剤により可溶化したのち、膜に再構成して得られる。この手法は、活性保持が困難、時間・コスト等が非効率、バイオハザードの危険、など多くの問題が残されている。この問題の解決に向け、本研究では、微粒子表面に担持した脂質膜（脂質膜コート微粒子）に対し、無細胞合成法により発現した膜タンパク質の直接組み込みを行うことを目的に研究を行った。研究遂行にあたり、以下の3点に焦点をあてて研究を遂行する。 1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、3) 膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用。研究の2年目にあたる2022年度は当初の計画に従い、ひきつづき上記の項目1)および2）について重点的に研究を行った。前年度までに、コロイド安定性の低い小さいリポソームとシリカ微粒子を混合し、膜融合を誘起することで、微粒子表面への脂質二分子膜を効率的に担持できることを明らかにしてきたが、このような微粒子を効率的に作成する手法を見出した。具体的には、新たに開発した脂質膜透過法を用い、脂質膜を効率的にコア微粒子に被覆する手法を見出した。また、磁性ナノ粒子を脂質膜と複合化する手法も開発した。さらに、複数の膜タンパク質を単一の微粒子に搭載するための手法の開発を目的として、固相合成法により脂質膜被覆微粒子に対して複数の膜タンパク質を簡便に搭載することが可能であることを予備的に明らかにした。

尽管占所有蛋白质一半以上的膜蛋白的人工合成方法的发展在基础生物学、医学和药理学中极为重要，但膜蛋白的简单合成仍然是不可能的。在这项研究中，我们将尝试一种尚未探索的科学技术，利用固相系统大量合成这种膜蛋白。传统上，膜蛋白是通过在大肠杆菌等中过度表达它们，用表面活性剂将它们溶解，然后将它们重构成膜来获得的。这种方法仍然存在许多问题，包括难以维持活性、时间和成本效率低下以及生物危害风险。为了解决这个问题，本研究旨在将无细胞合成表达的膜蛋白直接整合到微粒表面支撑的脂质膜（脂质膜包被的微粒）中。在开展研究时，我们将重点关注以下三点。 1）脂质膜包被微粒的制备和评估，2）无细胞膜蛋白合成和掺入膜，3）膜蛋白杂化微粒的功能评估和生物应用。 2022财年，即研究的第二年，我们按照原计划继续重点开展上述1）和2）项的研究。直到去年，我们已经发现，通过将胶体稳定性低的小脂质体与二氧化硅微粒混合并诱导膜融合，可以有效地在微粒表面支撑脂质双层膜。细颗粒。具体来说，我们发现了一种使用新开发的脂质膜渗透方法用脂质膜有效包覆核心颗粒的方法。我们还开发了一种将磁性纳米颗粒与脂质膜结合的方法。此外，为了开发一种将多个膜蛋白负载到单个微粒上的方法，我们初步发现可以使用固相合成将多个膜蛋白轻松地负载到脂质膜包被的微粒上。