高等真核生物でのDSB修復におけるコヒーシン複合体の機能とその制御機構の解明

阐明高等真核生物中粘连蛋白复合物在 DSB 修复中的功能和调节机制

基本信息

批准号：
22K06086
负责人：
東寅彦
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

コヒーシンはDNA二重鎖切断(DSB)時において積極的に修復反応に関わる一方、その分子的なメカニズムは未だ明らかになっていない点が多い。本研究ではツメガエル卵抽出液を用いた試験管内実験系およびヒト培養細胞での複製停止モデル系を使って高等真核生物でのコヒーシンによるDSB修復の分子機構の解明を試みた。（１）DSB修復におけるコヒーシンの挙動を調べるために、ツメガエル卵抽出液内で染色体にDSBを導入した。制限酵素EcoRIを抽出液に加えることでDSBに依存したコヒーシンの再結合が観察されると予想したが、結果としてはコヒーシンの結合量に大きな変化は観察されなかった。コヒーシンの再結合を評価するためには、損傷前後で染色体に結合するコヒーシンを区別することが今後重要であると考えられる。（２）染色体に再結合したコヒーシンは新たに姉妹間を接着することが酵母では報告されている。接着成立が高等真核生物において起きているのかを明確にするためには接着を定量的に評価する方法が必要である。新たな接着検出系の構築のため、ヒト組換えコヒーシンの精製を目指した。HEK293細胞での一過的なタンパク質発現を試みたが正しいストイキオメトリーのタンパク質発現が観察されなかったことから、さらなる条件の検討が必要である。（３）コヒーシンのDSB応答の仕組みがヒトの細胞でも保存されているのかを調べるため、ヒトU2O S細胞の複製停止系を用いた。この実験系では、ヒト染色体上に複製ブロックを作り、DNA複製の進行を妨げることができる。複製停止に伴いコヒーシンおよびローダーの蓄積が観察されるかを免疫染色法で解析したが、さらなる蓄積は観察されなかった。一方、興味深いことにコヒーシンSmc1のリン酸化は大きく蓄積することが観察されたことから、複製停止時においてコヒーシンを介したチェックポイントの活性化が起きていると考えられる。

尽管粘连蛋白积极参与 DNA 双链断裂 (DSB) 时的修复反应，但其分子机制的许多方面仍不清楚。在本研究中，我们尝试使用非洲爪蟾卵提取物的体外实验系统和培养的人类细胞中的复制停滞模型系统来阐明高等真核生物中粘连蛋白修复 DSB 的分子机制。 (1) 为了研究粘连蛋白在 DSB 修复中的行为，将 DSB 引入非洲爪蟾卵提取物的染色体中。我们预计通过向提取物中添加限制性酶 EcoRI 可以观察到 DSB 依赖性粘连蛋白重新结合，但结果是，没有观察到粘连蛋白结合量的显着变化。为了评估粘连蛋白重组，将来区分损伤前后与染色体结合的粘连蛋白将很重要。 (2) 据报道，在酵母中，与染色体重组的粘连蛋白在姐妹之间产生新的键。为了阐明高等真核生物中是否发生粘附建立，需要一种定量评估粘附的方法。我们的目的是纯化人重组粘连蛋白，以构建新的粘附检测系统。尽管我们尝试在 HEK293 细胞中瞬时表达蛋白质，但我们没有观察到具有正确化学计量的蛋白质表达，因此有必要进一步研究条件。 (3)为了研究粘连蛋白DSB反应机制在人类细胞中是否保守，我们使用了人类U2O S细胞复制阻滞系统。该实验系统在人类染色体上创建复制块，可以阻止 DNA 复制的进行。我们通过免疫染色分析是否观察到由于复制停滞而导致的粘连蛋白和装载机积累，但没有观察到进一步的积累。另一方面，有趣的是，观察到粘连蛋白 Smc1 的磷酸化显着积累，表明粘连蛋白介导的检查点激活发生在复制停滞期间。