酸性オルガネラ内Ca2+が関わる細胞内シグナリング解明のためのセンサー開発

开发传感器以阐明酸性细胞器中与 Ca2+ 相关的细胞内信号传导

基本信息

批准号：
18J11426
负责人：
篠田肇
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

報告者は、耐酸性の緑色蛍光タンパク質GamillusにCa2+反応性のタンパク質を融合し、リンカーアミノ酸の長さと種類の調整、センサー全体にランダムアミノ酸変異を導入することで、酸性環境（pH 4.5-6.0）で約200%の蛍光強度の変化率を示すCa2+センサーの開発に成功した。続いて、細胞内酸性環境のCa2+濃度範囲で作用するように、Ca2+結合ドメインに複数のアミノ酸変異を導入することで、Ca2+に対する親和性を調節した。哺乳類細胞内の酸性オルガネラ中のCa2+動態イメージングを通して、酸性オルガネラが関わる未知の情報伝達の発見、そのメカニズムの詳細解明が今後可能になると見込まれる。また、Gamillusに対してアミノ酸変異を導入することで、細胞酸性環境での超解像イメージングに使用できる、耐酸性・可逆的光スイッチ緑色蛍光タンパク質rsGamillusの開発にも成功した。rsGamillusは酸性環境（pH 4.5-6.0）で高い蛍光強度と光スイッチング効率を示した。実際に、超解像イメージング手法の一つであるPALM法と組み合わせることで、酸性環境中の細胞構造を光の回折限界を超えた分解能で観察することに成功した。今後、Ca2+センサーと光スイッチ性能を組み合わせた変異体を開発し、超解像イメージング法と応用することで、酸性オルガネラが関わるCa2+シグナル経路の高分解能観察が可能になると期待される。複数の国内・国外学会で本研究に関する発表を行い、現在権威ある学術雑誌に投稿中である。

作者将耐酸绿色荧光蛋白 Gamillus 与 Ca2+ 反应蛋白融合，调整了连接氨基酸的长度和类型，并在整个传感器中引入了随机氨基酸突变，以提高在酸性环境（pH 4.5）中的反应能力-6.0）。我们成功开发了一种荧光强度变化率约为 200% 的 Ca2+ 传感器。然后，他们通过在 Ca2+ 结合域中引入多个氨基酸突变来调节对 Ca2+ 的亲和力，使其在细胞内酸性环境中发现的一系列 Ca2+ 浓度下发挥作用。通过对哺乳动物细胞内酸性细胞器中Ca2+动力学的成像，预计将有可能发现涉及酸性细胞器的未知信息传递并阐明其机制的细节。此外，通过在Gamillus中引入氨基酸突变，我们成功开发了耐酸、可逆的光开关绿色荧光蛋白rsGamillus，可用于细胞酸性环境下的超分辨率成像。 rsGamillus 在酸性环境（pH 4.5-6.0）中表现出高荧光强度和光开关效率。事实上，通过将该方法与超分辨率成像技术之一的PALM方法相结合，我们成功地以超过光的衍射极限的分辨率观察酸性环境中的细胞结构。未来，预计通过开发结合Ca2+传感器和光开关性能的突变体并将其应用于超分辨率成像方法，观察涉及酸性细胞器的高分辨率Ca2+信号通路将成为可能。该研究已在多个国内外会议上发表，目前正在提交给权威学术期刊。