Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ卵作出系を応用した新規手法によるインプリント機構の解明

使用体外产蛋系统的新方法阐明印记机制

基本信息

批准号：
18J01481
负责人：
佐々木恵亮
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、これまでに確立した卵特異的遺伝子ノックダウンシステムの作用機序についてより詳細な解析を進めたとともに、卵形成におけるヒストン脱メチル化酵素の包括的な阻害による影響を調べた。1) 人工microRNAによる卵特異的遺伝子ノックダウン：前年度までに、卵母細胞で発現するZp3遺伝子のイントロンに人工的に配列を設計したmicroRNA様配列(amiRNA)を挿入することで、成長期以降の卵母細胞に特異的な遺伝子ノックダウン効果が得られることがわかった。本年度は、ノックダウンマウスの様々なステージの卵母細胞における外来amiRNA発現プロファイルを明らかにした。また、内在性遺伝子を標的とした場合のノックダウン効果の検証を行ったことで、本システムによるノックダウン効果はamiRNA転写のホスト遺伝子Zp3と標的となる内在性遺伝子の新規転写が起こるタイミングの同期性が重要であると考えられた。本研究成果を学術論文として発表した。2) 卵成長過程におけるヒストンH3K4脱メチル化遺伝子の多重阻害：ゲノムインプリンティングの確立に重要なヒストンH3における4番目のリジン(H3K4)の脱メチル化現象に着目し、卵母細胞で発現するH3K4脱メチル化酵素遺伝子群Kdmファミリーをin vitroで多重に阻害した。1)で利用したamiRNAをポリシストロニックに連結することで最大10個のamiRNAを単一の転写ユニットから発現できる系を構築し、このコンストラクトをインプリント確立前の卵母細胞に顕微操作により導入して成長完了卵を得た。その結果、機能既知のKdm1aやKdm1bだけでなく、機能未知のKdm遺伝子群も卵におけるH3K4脱メチル化に関与することがわかった。今後これら機能未知のKdm遺伝子群がインプリント領域を直接的に制御するのかを検証する必要がある。

今年，我们对目前已建立的卵子特异性基因敲低系统的作用机制进行了更详细的分析，并研究了综合抑制组蛋白去甲基化酶对卵子发生的影响。 1）利用人工microRNA敲低卵子特异性基因：通过将人工设计的microRNA样序列（amiRNA）插入到前一年卵母细胞表达的Zp3基因的内含子中，实现生长期后卵子特异性基因的敲除发现获得了卵母细胞特异性的基因敲低效果。今年，我们揭示了敲除小鼠不同阶段卵母细胞中外源amiRNA的表达谱。此外，通过验证靶向内源基因时的敲低效果，我们发现该系统的敲低效果是由于amiRNA转录的宿主基因Zp3的新转录与目标内源基因的新转录的时序同步。被认为很重要。这项研究的结果以学术论文的形式发表。 2）卵子生长过程中组蛋白H3K4去甲基化基因的多重抑制：针对组蛋白H3中第四个赖氨酸（H3K4）的去甲基化现象，这对建立基因组印记很重要，我们重点研究了第四个赖氨酸的去甲基化现象（ H3K4）存在于组蛋白 H3 中，对于基因组印记的建立非常重要，并且抑制了卵母细胞中 H3K4 的表达。去甲基化酶基因的 Kdm 家族在体外被多次抑制。通过1)中使用的amiRNA的多顺反子连接，构建了能够从单个转录单元表达多达10个amiRNA的系统，并且在印记建立之前通过显微操作将该构建体引入卵母细胞并获得完全生长的卵。结果发现，鸡蛋中H3K4去甲基化不仅涉及功能已知的Kdm1a和Kdm1b，而且还涉及功能未知的Kdm基因。未来有必要验证这些功能未知的Kdm基因是否直接控制印迹区域。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

卵母細胞特異的遺伝子ノックダウンシステムの開発

卵母细胞特异性基因敲低系统的开发

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
佐々木恵亮;尾畑やよい
通讯作者：
尾畑やよい

Oocyte-specific gene knockdown by intronic artificial microRNAs driven by Zp3 transcription in mice

<i>Zp3</i> 转录驱动的内含子人工 microRNA 敲低小鼠卵母细胞特异性基因

DOI：
10.1262/jrd.2020-146
发表时间：
2021-06-21
期刊：
影响因子：
1.8
作者：
Sasaki K;Takaoka S;Obata Y
通讯作者：
Obata Y

Ectopic expression of DNA methyltransferases DNMT3A2 and DNMT3L leads to aberrant hypermethylation and postnatal lethality in mice

DNA 甲基转移酶 DNMT3A2 和 DNMT3L 的异位表达导致小鼠异常高甲基化和产后致死

DOI：
10.1002/mrd.23137
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
2.5
作者：
Sasaki Keisuke;Hara Satoshi;Yamakami Reina;Sato Yusuke;Hasegawa Saki;Kono Tomohiro;Morohaku Kanako;Obata Yayoi
通讯作者：
Obata Yayoi

卵母細胞特異的ノックダウンシステムの確立

卵母细胞特异性敲低系统的建立