繰り返し型ポリケタイド合成酵素の機能解析とプログラミング制御の解明

重复聚酮合酶的功能分析和编程控制

基本信息

批准号：
17J00911
负责人：
鵜飼孝大
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J00911/
关键词：
ポリケタイド生合成異種発現糸状菌天然物

项目摘要

本年度は、生合成経路の不明なシクロペンテン骨格を有する天然物テレイン、パルメノンの生合成研究を行った。同時に、繰り返し型PKSを材料としたキメラ酵素の機能解析を行った。テレインとパルメノンの生合成遺伝子クラスターを精査したところ、各化合物に特有の生合成遺伝子を見出したため、機能解析を行った。その結果、テレイン生合成経路においては、機能が不明であったFMO遺伝子、パルメノン生合成においては化学的性質の異なる2か所を連続してクロロ化するフラビン依存ハロゲン化酵素の解析に成功した。並行して、ポリケタイド合成酵素-非リボソームペプチド合成酵素(PKS-NRPS)を材料としたキメラ酵素遺伝子の調製、並びにキメラ酵素の機能解析も行った。まず、酵素生成物を酵素から切り出すためのドメインについて、予想ドメイン間領域において複数のキメラ酵素遺伝子を作成し、麹菌において異種発現させたところ、非天然型の化合物の生産に成功した。以上から、麹菌が単なる異種発現宿主ではなく、機能を改変した酵素の解析に適していることを再確認できた。本結果をもとに研究を継続する上で、迅速なキメラ酵素遺伝子の構築方法が必要であったため、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9に着目した。麹菌の染色体上に、キメラ酵素遺伝子のベースをあらかじめ導入しておく。その形質転換体においてCas9タンパク質を発現させてベース遺伝子の任意の領域を切断し、相同組み換えで標的遺伝子を組み込んだキメラ酵素遺伝子をin vivoで構築した。本手法を用い、機能解析済みのPKS-NRPSの中から相同性が40～80％程度の組み合わせを計10種類作成し、麹菌を用いて機能解析を試みた。その結果、相同性を指標とした研究対象選定の基準が示唆された。

今年，我们对土曲醇和巴美酮的生物合成进行了研究，这两种具有环戊烯骨架的天然产物，其生物合成途径尚不清楚。同时，我们对由重复 PKS 制成的嵌合酶进行了功能分析。在检查了terrain和parmenone的生物合成基因簇后，他们发现了每种化合物特有的生物合成基因，然后对其进行了功能分析。结果，我们成功分析了在地形生物合成途径中功能未知的FMO基因，以及黄素依赖性卤化酶，该卤化酶在巴甲酮生物合成中顺序氯化两个具有不同化学性质的位点。同时，我们以聚酮合酶-非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）为材料制备了嵌合酶基因，并对嵌合酶进行了功能分析。首先，关于从酶中切除酶产物的结构域，在预测的结构域间区域中创建了多个嵌合酶基因并在米曲霉中异源表达，并成功产生了非天然化合物。综上所述，我们再次证实米曲霉不仅是异源表达宿主，而且适合分析功能修饰的酶。为了基于这些结果继续我们的研究，我们需要一种快速的方法来构建嵌合酶基因，因此我们将重点放在基因组编辑技术CRISPR/Cas9上。将嵌合酶基因的碱基预先导入米曲霉的染色体中。在转化子中表达Cas9蛋白，切割基础基因的任意区域，并在体内构建通过同源重组整合目标基因的嵌合酶基因。使用该方法，我们从功能分析的PKS-NRPS中创建了总共10个同源性约为40%至80%的组合，并尝试使用米曲霉进行功能分析。因此，提出了以同源性为指标选择研究对象的标准。