ダイオキシン受容体（ＡＨＲ）のリガンド認識及び転写活性化機構の構造科学的解明

二恶英受体（AHR）配体识别和转录激活机制的结构科学阐明

基本信息

批准号：
17J10586
负责人：
櫻井駿也
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではダイオキシン受容体(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)についてリガンドの詳細な認識機構及び一連の転写制御機構の解明を目指し、構造生物学的な研究を行った。具体的には転写活性化複合体であるAHR/ARNT/リガンド/DNA複合体、転写抑制複合体であるAHRR/ARNTについてX線結晶構造解析または電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を目指した。前年度までにAHR/ARNTについて熱安定性を向上させた変異体を作製し、結晶化スクリーニングを行った。また、AHRR/ARNTについては結晶構造解析に成功し、AHRRによるAHRの転写抑制機構の構造基盤を明らかにした(Sakurai et al., J Biol Chem., 2017)。本年度はAHR/ARNTについて、フラグメント抗体であるFv-claspとの複合体での結晶化を目指した。Fv-claspは従来のフラグメント抗体に比べて構造の柔軟性が少なく、結晶性が良いという特徴を持つ。抗体にはPAペプチド(GVAMPGAEDDVV)を認識するNZ-1を用いた。PAペプチドはそれ自身がβターン構造を形成するという特徴を持つことから、AHR、ARNTのβターンまたはループ領域にPAペプチドを挿入した。PAペプチドを挿入したAHR/ARNTについて発現量及びNZ-1結合能が良好なペプチド挿入位置をAHR、ARNTそれぞれ2か所、5か所見出した。それらの挿入位置を組み合わせて1～6か所PAペプチドを挿入したAHR/ARNTの高純度サンプルを調製した。得られたサンプルについてNZ-1 Fv-claspとの結合を確認し、NZ-1との複合体を調製した。得られたサンプルを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、結晶を得ることはできなかった。また、AHR/ARNT/リガンド/DNAについて、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を行い、12オングストロームと低分解能ではあるが三次元密度マップを得ることに成功した。得られたマップはHIF/ARNTなどのbHLH-PASファミリーの結晶構造から予測されるモデルと同様の形状をしていた。

在本研究中，我们对二恶英受体（芳基碳氢化合物受体，AHR）进行了结构生物学研究，旨在阐明详细的配体识别机制和一系列转录控制机制。具体来说，我们的目标是通过X射线晶体结构分析或单粒子分析，确定AHR/ARNT/配体/DNA复合物（转录激活复合物）和AHRR/ARNT（转录抑制复合物）的结构。电子显微镜。到前一年，我们已经创建了热稳定性提高的AHR/ARNT突变体并进行了结晶筛选。此外，我们成功分析了AHRR/ARNT的晶体结构，阐明了AHRR对AHR转录抑制机制的结构基础(Sakurai et al., J Biol Chem., 2017)。今年，我们的目标是使 AHR/ARNT 与片段抗体 Fv-clasp 形成复合物。与传统片段抗体相比，Fv-clasp 的特点是结构灵活性较低，结晶度较好。使用识别PA肽(GVAMPGAEDDVV)的NZ-1作为抗体。由于PA肽本身具有形成β-转角结构的特性，因此将PA肽插入到AHR和ARNT的β-转角或环区域中。对于插入PA肽的AHR/ARNT，我们分别在AHR和ARNT中发现了2个和5个具有良好表达水平和NZ-1结合能力的肽插入位置。通过组合这些插入位置来制备在 1 至 6 个位置插入 PA 肽的 AHR/ARNT 的高纯度样品。确认得到的样品与NZ-1 Fv-clasp的结合，制备与NZ-1的复合物。使用得到的样品进行结晶筛选，但没有得到结晶。我们还使用冷冻电子显微镜对 AHR/ARNT/配体/DNA 进行了单粒子分析，并成功获得了三维密度图，尽管分辨率较低，为 12 埃。获得的图谱与根据bHLH-PAS家族（例如HIF/ARNT）的晶体结构预测的模型具有相似的形状。