人工ｍＲＮＡによるヒトｉＰＳ細胞由来各種心筋細胞の分離純化法確立と移植後評価

利用人工mRNA建立人iPS细胞来源的各种心肌细胞的分离纯化方法及移植后评价

基本信息

批准号：
16J11292
负责人：
羽溪健
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J11292/
关键词：
iPS細胞由来心筋細胞 miRNA switch 電子顕微鏡心筋細胞移植

项目摘要

心筋細胞には心室筋細胞、心房筋細胞、ペースメーカー細胞などの種類が存在し、当研究室で開発したmiRNA switchを用いてこれらの各種心筋細胞を分離純化するのが目的である。まず、新生仔マウス心室筋細胞及び心房筋細胞を用いてmiRNA switchを検討したところ、心室筋特異的miRNA switchは心室筋のみ反応し、心房筋には反応しないことが確かめられた。miR-1 switchは両心筋細胞に反応するため、miR-1 switch陽性及び心室筋特異的miRNA switch陽性/陰性によって、心室筋細胞及び心房筋細胞を選別できた。次に、実際にヒトiPS細胞由来心筋細胞にそれらを導入したが、各心筋細胞を分離純化することはできなかった。これには心筋の成熟度が関与していると考え、マウスの胎児心室筋とadult心室筋のマイクロアレイを用いて、胎児心室筋に有意に強く発現しているmiRNAの候補を抽出した。各候補のmiRNA switchを作製し、現在検討している。また、免疫不全マウスに対して移植したヒトiPS細胞由来心筋細胞を電子顕微鏡で評価するため、近年報告された電子顕微鏡画像で認識できる遺伝子を利用した。なぜなら、電子顕微鏡画像は非常に倍率が高く、画像内でどれが宿主心筋細胞でどれが移植心筋細胞か判別がつかないからである。細胞核が染色されるようにこの遺伝子をヒトiPS細胞に導入し、分化誘導したヒトiPS細胞由来心筋細胞を免疫不全マウスに移植し、移植後6ヶ月後にもこの遺伝子が働いていることを確認した。移植したヒトiPS細胞由来心筋細胞を電子顕微鏡によって構造学的に評価したところ、心筋細胞を電気生理学的に安定させるT細管、dyadが移植心筋細胞内に形成されていることが判明した。これらの構造物は移植後3ヶ月では認められず、移植後6ヶ月で形成され始めていることも判明した。

心肌细胞有不同类型，包括心室肌细胞、心房肌细胞和起搏细胞，我们的目标是使用我们实验室开发的 miRNA switch 分离和纯化这些不同类型的心肌细胞。首先，我们使用新生小鼠心室肌细胞和心房肌细胞研究了 miRNA 开关，并证实心室肌特异性 miRNA 开关仅对心室肌有反应，但对心房肌没有反应。由于 miR-1 开关与两种类型的心肌细胞发生反应，因此我们能够根据 miR-1 开关阳性和心室肌特异性 miRNA 开关阳性/阴性来选择心室肌细胞和心房肌细胞。接下来，他们实际上将它们引入人类 iPS 细胞来源的心肌细胞中，但他们无法分离和纯化每个心肌细胞。我们认为心肌的成熟水平与此有关，并且使用小鼠胎儿和成人心室肌的微阵列，我们提取了在胎儿心室肌中显着且强烈表达的候选miRNA。我们已经为每个候选者创建了 miRNA 开关，目前正在研究它们。此外，为了使用电子显微镜评估移植到免疫缺陷小鼠体内的人类 iPS 细胞来源的心肌细胞，我们使用了最近报道的可以在电子显微镜图像中识别的基因。这是因为电镜图像的放大倍数极高，很难区分图像中哪些心肌细胞是宿主心肌细胞，哪些是移植心肌细胞。将该基因导入人iPS细胞中，对细胞核进行染色，并将分化的人iPS细胞来源的心肌细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，并证实该基因在移植后6个月仍然发挥功能。当使用电子显微镜对移植的人iPS细胞来源的心肌细胞进行结构评估时，发现在移植的心肌细胞内形成了T管、二联体，其在电生理学上稳定心肌细胞。还发现这些结构在移植后3个月还没有观察到，并在移植后6个月开始形成。