人工環化ｍＲＮＡを用いた生体内標的細胞特異的な遺伝子発現制御技術の開発

利用人工环化mRNA开发体内靶细胞特异性基因表达控制技术

基本信息

批准号：
16J10865
负责人：
和田俊輔
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度、人工mRNAの化学修飾及び5’非翻訳領域配列について種々の検討を行い、それらの結果をもとにmiR-122の標的配列を1-4つ有するFLuc mRNAを作成した。それぞれのmRNAをInvivofectamine mRNAと複合体を形成させ、ヌードマウスに20 ug/headで投与した。4時間後のイメージングにおいて、コントロールFLuc mRNAでは肝臓での発現が認められたが、miR-122の標的配列を持つFLuc mRNAを投与したマウスの肝臓ではルシフェラーゼ発現量が顕著に低下していた。また、同マウスの脾臓においてルシフェラーゼの活性が認められることからmiR-122応答型mRNAスイッチが肝臓において内在性miR-122に応答し、発現を低減させていることが示された。次にこれらのmRNAを肺へ導入し、その発現をIVISにて評価した。その結果、全てのmRNAで同程度のFLucの活性が肺で確認され、miR-122応答型mRNAスイッチが肝臓の内在性miR-122特異的に応答していることが示された。次にmiR-122特異的にmRNAの発現がONになる単純回路を構築した。L7Aeが発現しているとKink-turn (Kt)を持つmRNAに結合し、その翻訳を妨げる。一方、miR-122によりL7Ae mRNAが分解されると、Ktを持つFLuc mRNAはL7Aeによる翻訳阻害が低下し、翻訳がONの状態となる。まず、L7Ae mRNAとFLuc mRNAの投与量比を検討した。その結果、L7Ae mRNA量対FLuc mRNA量が1:1のときに脾臓でのFLucの発現を顕著に抑制できた。また、予備検討段階ではあるが、臓器特異的にmRNAの発現をONすることに成功した。

今年，我们对人工mRNA和5'非翻译区序列的化学修饰进行了各种研究，并基于这些结果，我们创建了具有1-4个miR-122靶序列的FLuc mRNA。每种 mRNA 与 Invivofectamine mRNA 复合，并以 20 ug/头给予裸鼠。 4小时后的成像显示，对照FLuc mRNA在肝脏中表达，但给予FLuc mRNA（具有miR-122靶序列）的小鼠肝脏中荧光素酶表达水平显着降低。此外，在同一小鼠的脾脏中观察到荧光素酶活性，表明 miR-122 响应 mRNA 开关响应肝脏中的内源性 miR-122 并降低其表达。接下来，这些 mRNA 被引入肺部，并使用 IVIS 评估它们的表达。结果，在肺中所有 mRNA 均证实了相似水平的 FLuc 活性，表明 miR-122 响应 mRNA 开关特异性响应肝脏中的内源性 miR-122。接下来，我们构建了一个简单的电路，专门针对 miR-122 打开 mRNA 表达。当 L7Ae 表达时，它通过 Kink-turn (Kt) 与 mRNA 结合并阻止其翻译。另一方面，当L7Ae mRNA被miR-122降解时，对于具有Kt的FLuc mRNA，L7Ae的翻译抑制减弱，并且翻译变为ON。首先，检查L7Ae mRNA和FLuc mRNA的剂量比。结果，当L7Ae mRNA与FLuc mRNA的比例为1:1时，可以显着抑制脾脏中FLuc的表达。此外，尽管仍处于初级阶段，但我们成功地以器官特异性方式开启 mRNA 表达。