高親和性を有する新規ヘム結合蛋白質のｄｅ　ｎｏｖｏ計算設計とその実験的検証

一种新型高亲和力血红素结合蛋白的从头计算设计及实验验证

基本信息

批准号：
16J04268
负责人：
森脇由隆
金额：
$ 2.08万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J04268/
关键词：
タンパク質ヘム計算化学

项目摘要

本研究課題の目的は高親和性を有する新規ヘム結合タンパク質の計算機による設計と実験的検証であった。ヘムは微生物や植物からヒトに至るまで様々な生物が生命の維持活動に利用している、汎用性の高い化学物質であり、一分子のヘムの中に鉄を一原子持つ。また、タンパク質の人工的な創出は、生物物理学だけでなく情報学・統計学も用いて積極的にその理論化を推し進めている分野であり、この研究分野の発展は薬剤としての応用や人工酵素の創出につながる。したがって新規ヘム結合タンパク質の創出は生命活動を根底から支える分子の人工的創出であると言える。その第1段階として、「天然に存在する非ヘム結合性タンパク質を主鎖構造から再設計し、ヘム分子と結合できるよう改変する」ことを初年度の目的とした。まず天然に存在する非ヘム結合性タンパク質として、内部に大きな空隙を持つタンパク質PA3332 (PDB ID: 1z1s)を選択し、ヘムが結合できるだけの十分なスペースを用意するためにC末端のαヘリックスと残基No.34-43に存在するフレキシブルなループ構造をそれぞれβシート構造および最小限のループ構造に改変した。続いてこの主鎖構造をもとに、ヘムとの結合に適するようアミノ酸側鎖の配置を最適化した。これらの条件をもとに、タンパク質モデリングソフトウェアRosetta program suiteを用いて、アミノ酸の側鎖の改変およびエネルギーに基づく構造最適化を計算機上で行い、改変体をデザインした。最後にデザインしたアミノ酸配列をコードするプラスミドを発注し大腸菌発現系にて発現・精製を試みた。精製タンパク質はヘム結合タンパク質に特有な赤茶色を呈していたことからヘム結合能を一部有していると考えられた。今後さらなる検証と親和性の向上、そしてテンプレート無しでのヘム結合タンパク質の創出に向けた取り組みを進めていくことにしている。

该研究项目的目的是对一种具有高亲和力的新型血红素结合蛋白进行计算设计和实验验证。血红素是一种用途广泛的化学物质，被从微生物、植物到人类的多种生物体用来维持生命。此外，蛋白质的人工创造是一个不仅利用生物物理学而且利用信息学和统计学积极推动理论化的领域，而该研究领域的发展是由于其作为药物和人工酶的创造的应用。因此，新的血红素结合蛋白的创造可以说是人工创造了从根本上支持生命活动的分子。作为第一步，第一年的目标是“重新设计天然存在的非血红素结合蛋白的主链结构并对其进行修饰，以便它们能够与血红素分子结合。”首先，我们选择 PA3332（PDB ID：1z1s），一种具有大内腔的蛋白质，作为天然存在的非血红素结合蛋白。将第 34-43 组中存在的柔性环结构修饰为 β-折叠。结构和最小循环结构。接下来，基于该主链结构，优化了氨基酸侧链的排列，使其适合与血红素结合。基于这些条件，我们利用蛋白质建模软件Rosetta程序套件在计算机上进行基于氨基酸侧链和能量修饰的结构优化，设计了修饰产物。最后，我们订购了编码设计的氨基酸序列的质粒，并尝试使用大肠杆菌表达系统表达和纯化它。由于纯化的蛋白质表现出血红素结合蛋白质特征的红棕色，因此认为其具有一定的血红素结合能力。未来，我们计划进一步验证这一点，提高亲和力，并致力于创建无模板的血红素结合蛋白。