ＤＮＡヘリカーゼ装着における複製開始複合体の機能構造動態とその制御の解明

阐明复制起始复合物的功能结构动力学及其在 DNA 解旋酶附着过程中的调节

• 批准号: 16J02075
• 负责人: 﨑山 友香里
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J02075/
• 关键词: oriC; DnaA; 高次複合体; DNA複製開始反応; ヘリカーゼ装着; 大腸菌; 染色体複製開始; DnaBヘリカーゼ; DiaA; 一本鎖DNA結合

本年度の前半は、大腸菌染色体の複製起点oriC上でのDnaA多量体形成から一本鎖oriC DNA結合までの分子機構に関する研究成果を筆頭論文として投稿し、その追加実験に時間を費やした(2017年9月末、論文受理)。この機構はDnaBヘリカーゼ装着の前段階である。本年度の後半に以下の課題に取り組んだ。(1)大腸菌細胞内でのDnaB-DnaA相互作用の検討：これまでの生化学的解析により、oriC上で形成されたDnaA多量体中の特定のDnaA分子が、DnaBと機能的な相互作用をもつと示唆されていた。大腸菌細胞内でも解析を行うため、DnaB-DnaA結合と競合するDiaAを欠損させた株を用いて、oriC内の特定のDnaA結合部位にDnaB結合能欠損変異DnaAを導入した。この細胞の複製開始能を解析した結果、生化学的解析結果が支持された。(2)DnaB装着時における一本鎖DNA結合の意義の解明：oriCの左側領域上に形成されるDnaAサブ多量体が一本鎖oriC DNAと結合することを見出していたが、本年度の試験管内構成系を用いた解析研究により、右側DnaAサブ複合体も一本鎖oriC DNAと結合すること、そしてこれがDnaB装着を促進することが示唆された。また、oriCの左側領域では、DnaA濃度が十分高い場合と異なり、低濃度DnaAでは、片側の一本鎖oriC DNAのみにDnaBが優先的に装着されることが示唆された。以上の結果から、oriC上で形成された各DnaAサブ複合体が、一本鎖oriC DNAと結合して一本鎖状態を安定化させることで、効率のよい両鎖へのDnaB装着が進められると考えられた。

今年上半年，我们作为主论文提交了从大肠杆菌染色体复制起点oriC上DnaA多聚体形成到单链oriC DNA结合的分子机制的研究成果，并花时间进行了补充实验（2017年论文9月底接受）。该机制是 DnaB 解旋酶附着的前体。今年下半年，我们主要做了以下工作。 (1)大肠杆菌细胞内的DnaB-DnaA相互作用的检查：先前的生化分析表明，在oriC上形成的DnaA多聚体中的特定DnaA分子与DnaB具有功能性相互作用。为了在大肠杆菌细胞中进行分析，我们使用缺乏 DiaA 的菌株将缺乏 DnaB 结合能力的突变体 DnaA 引入 oriC 内的特定 DnaA 结合位点，该菌株与 DnaB-DnaA 结合竞争。对这些细胞启动复制能力的分析支持了生化分析结果。 (2) 阐明DnaB附着时单链DNA结合的意义：发现在oriC左侧区域形成的DnaA亚多聚体与单链oriC DNA结合，但今年，体外分析研究使用组成系统表明正确的 DnaA 子复合物也与单链 oriC DNA 结合，并且这促进了 DnaB 附着。此外，在oriC的左侧区域中，与DnaA浓度足够高时不同，表明在低浓度的DnaA下，DnaB优先仅附着于一条单链oriC DNA。由以上结果可知，在oriC上形成的各DnaA亚复合体与单链oriC DNA结合，使单链状态稳定化，从而使DnaB有效地附着于双链。

项目成果

Near-atomic structural model for bacterial DNA replication initiation complex and its functional insights

细菌DNA复制起始复合物的近原子结构模型及其功能见解

• DOI: 10.1073/pnas.1609649113
• 发表时间: 2016
• 作者: Masahiro Shimizu; Yasunori Noguchi; Yukari Sakiyama; Hironori Kawakami; Tsutomu Katayama;Shoji Takada
• 通讯作者: Shoji Takada

Structure, mechanism and regulation of Escherichia coli replication initiation complexes in DNA unwinding

大肠杆菌DNA解旋复制起始复合物的结构、机制和调控

• 发表时间: 2016
• 作者: Tsutomu Katayama; Yukari Sakiyama; Yasunori Noguchi;Hironori Kawakami
• 通讯作者: Hironori Kawakami

大腸菌の複製開始複合体における二重鎖DNA開裂とヘリカーゼ相互作用の分子機構

大肠杆菌复制起始复合物中双链 DNA 切割和解旋酶相互作用的分子机制

• 发表时间: 2016
• 作者: 片山 勉;崎山 友香里;赤間 勇介;野口 泰徳;川上 広宣;加生 和寿
• 通讯作者: 加生 和寿

Near-atomic structural model for bacterial DnaA replication initiation complex and its functional insights

细菌 DnaA 复制起始复合物的近原子结构模型及其功能见解

• 发表时间: 2017
• 作者: Masahiro Shimizu; Yasunori Noguchi; Yukari Sakiyama; Hironori Kawakami; Tsutomu Katayama;Shoji Takada
• 通讯作者: Shoji Takada

Functional dynamics of replication initiation complex in Escherichia coli

大肠杆菌复制起始复合物的功能动力学

• 发表时间: 2016
• 作者: Yukari Sakiyama; Yasunori Noguchi; Hironori Kawakami;Tsutomu Katayama
• 通讯作者: Tsutomu Katayama