Creation of collagen-binding endothelial growth factor by molecular evolutionary engineering

通过分子进化工程创建胶原结合内皮生长因子

基本信息

批准号：
16F16059
负责人：
伊藤嘉浩
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

生理活性タンパク質に結合性を付与して応用する試みの一つとして、コラーゲン結合性血管内皮細胞成長因子（VEGF)の調製を進化分子工学の手法で行った。従来タンパク質に結合性を付与する場合には、結合性ペプチドを遺伝子組み換え技術で導入することが行われてきた。コラーゲン結合性を付与する場合、生体中のコラーゲン結合性領域の配列を成長因子に融合導入することで行われた。しかし、この手法では、融合前の結合性配列のコンフォメーションが融合後に成長因子の配列で別のコンフォメーションに誘起されて結合性が喪失してしまう恐れがある。そこで、本研究では、成長因子に直接ランダム配列ペプチドを融合したライブラリーを調製し、その中から進化分子工学によって、コラーゲンに結合する成長因子タンパク質を選別する方法をとった。すなわち、結合性をもとにテーラーメイドでコラーゲン結合性成長因子を合成することを目指した。成長因子には、皮膚科医用や心筋梗塞の治療薬としても検討されているVEGFを選んだ。このカルボキシル末端にランダム配列のペプチドライブリーを付与して、進化分子工学の手法の一つであるリボソーム・ディスプレイで選別を行った。選別された結合性成長因子を遺伝子工学で作成した。そして、このコラーゲン結合性を検討すると、単に既存のコラーゲン結合性ペプチドを融合した場合に比べて高い結合活性を持つことがインビトロ・アッセイにより分かった。そこで、これを皮膚潰瘍モデルと心筋梗塞モデルのマウスに投与して、生体内での活性を調べたところ、両モデルで、皮膚再生や心筋再生が観測される結果となった。蛍光ラベル化した結合性VEGFを使って、損傷部位への集積も観測された。このように結合性タンパク質を進化分子工学で設計する方法を新たに"all-in-one"試験管内選別法と名付けた。

作为将结合特性应用于生理活性蛋白质的尝试，我们使用进化分子工程技术制备了胶原结合血管内皮生长因子（VEGF）。传统上，当赋予蛋白质结合特性时，已使用基因重组技术引入结合肽。当赋予胶原蛋白结合特性时，这是通过将活体中的一系列胶原蛋白结合区域融合到生长因子中来实现的。然而，使用这种方法，存在这样的风险：融合前的结合序列的构象可能被融合后的生长因子序列诱导成不同的构象，导致结合丧失。因此，在本研究中，我们制备了一个随机序列肽直接与生长因子融合的文库，并利用进化分子工程来选择与胶原蛋白结合的生长因子蛋白。换句话说，我们的目标是根据胶原蛋白结合生长因子的结合特性以定制的方式合成它们。作为生长因子，我们选择了 VEGF，它被皮肤科医生使用，也被考虑用于治疗心肌梗塞。将具有随机序列的肽库连接到羧基末端，并使用核糖体展示（一种进化分子工程方法）进行选择。选定的结合生长因子是通过基因工程产生的。在检查这种胶原蛋白结合特性时，体外测定表明它比简单融合现有的胶原蛋白结合肽具有更高的结合活性。因此，当将其给予皮肤溃疡模型和心肌梗塞模型的小鼠以检查其体内活性时，在两种模型中均观察到皮肤再生和心肌再生。使用荧光标记的结合 VEGF 也观察到损伤部位的积累。我们将这种利用进化分子工程设计结合蛋白的方法命名为“一体化”体外选择方法。

项目成果

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“All-in-one” in vitro selection of collagen-binding vascular endothelial growth factor

胶原结合血管内皮生长因子的“一体式”体外筛选

DOI：
10.1016/j.biomaterials.2018.01.055
发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
14
作者：
Park Shin;Uzawa Takanori;Hattori Fumiyuki;Ogino Shuichi;Morimoto Naoki;Tsuneda Satoshi;Ito Yoshihiro
通讯作者：
Ito Yoshihiro