パーキンソン病原因遺伝子産物ＰＩＮＫ１とＰａｒｋｉｎの構造基盤の確立

帕金森病致病基因产物PINK1和Parkin结构基础的建立

• 批准号: 15J10559
• 负责人: 尾勝 圭
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J10559/
• 关键词: パーキンソン病; ミトコンドリア; リン酸化; マイトファジー; Parkin; PINK1; ユビキチン; キナーゼ

PINK1とParkinはパーキンソン病の原因遺伝子産物である。細胞内では膜電位の低下した不良ミトコンドリアを分解することが報告されている。この過程でPINK1はユビキチンとParkinのユビキチン様ドメイン(UBLドメイン)をリン酸化する。近年、複数の研究グループが自己阻害型Parkinの立体構造とリン酸化ユビキチン結合型Parkinの立体構造を明らかにしている。本研究では未だに報告のないPINK1の立体構造解析に焦点を当てて制御機構や基質の選択性を明らかにするために研究を行った。初年度に不均一なリン酸化状態のPINK1から主要なリン酸化部位を同定し、均一なサンプルを得られる発現・精製系を構築した。その発現・精製系を用いることでPINK1の結晶化に成功した。X線結晶構造解析の結果、ATP非加水分解性アナログ結合型PINK1の構造が明らかとなった。PINK1のATP認識機構が明らかになると同時に、C末端側に位置するPINK1独自の構造も明らかにできた。PINK1の構造を基にして生化学的解析と細胞生物学的解析を行うことでPINK1のユビキチン認識に重要な残基を検証した。また、部位特異的架橋法によりユビキチン側のPINK1結合部位も明らかにした。PINK1のcatalytic grooveの幅は直線状の基質を認識するキナーゼより広く、立体構造を認識するキナーゼに近い特徴があった。さらにPINK1とユビキチンの相互作用面は対照的な表面電荷を有していた。これらはPINK1の基質の選択性に影響を与えていると考えられる。一方で、ミトコンドリアには脱ユビキチン化酵素USP30が存在していることが知られており、USP30がParkinによるユビキチン化の逆反応を行うことが示唆されている。USP30の構造を基にした変異体解析を培養細胞を用いて行い、主にK63鎖及びK6鎖の変化を観察した。

PINK1 和 Parkin 是导致帕金森病的基因产物。据报道，在细胞内部，它会降解有缺陷的线粒体，膜电位降低。在此过程中，PINK1 磷酸化泛素和 Parkin 的泛素样结构域（UBL 结构域）。近年来，多个研究小组揭示了自抑制性Parkin和磷酸化泛素结合Parkin的三维结构。在本研究中，我们重点对尚未报道的PINK1进行三维结构分析，以阐明其调控机制和底物选择性。第一年，我们确定了具有异质磷酸化状态的PINK1的主要磷酸化位点，并构建了表达和纯化系统，使我们能够获得均一的样品。通过使用该表达和纯化系统，我们成功地结晶了PINK1。 X射线晶体结构分析的结果揭示了ATP不可水解类似物结合PINK1的结构。在阐明PINK1的ATP识别机制的同时，PINK1位于C端侧的独特结构也被揭示。通过基于PINK1的结构进行生化和细胞生物学分析，我们验证了PINK1对泛素识别重要的残基。此外，还使用位点特异性交联方法揭示了泛素侧的 PINK1 结合位点。 PINK1催化槽的宽度比识别线性底物的激酶宽，其特性与识别三维结构的激酶相似。此外，PINK1 和泛素的相互作用表面具有不同的表面电荷。这些被认为影响 PINK1 的底物选择性。另一方面，已知线粒体中存在去泛素化酶USP30，并且有人提出USP30进行Parkin泛素化的逆反应。我们利用培养细胞，根据USP30的结构进行了突变分析，主要观察K63链和K6链的变化。

项目成果

ユビキチンキナーゼPINK1のX線結晶構造解析

泛素激酶PINK1的X射线晶体结构分析

• 发表时间: 2018
• 作者: 尾勝 圭

Structural basis for specific cleavage of Lys6-linked polyubiquitin chains by USP30

USP30 对 Lys6 连接的多聚泛素链进行特异性切割的结构基础

• DOI: 10.1038/nsmb.3469
• 发表时间: 2017
• 影响因子: 16.8
• 作者: Sato Yusuke;Okatsu Kei;Saeki Yasushi;Yamano Koji;Matsuda Noriyuki;Kaiho Ai;Yamagata Atsushi;Goto;Ishikawa Minoru;Hashimoto Yuichi;Tanaka Keiji;Fukai Shuya
• 通讯作者: Fukai Shuya