マキシアニオンチャネルの分子同定

最大阴离子通道的分子鉴定

基本信息

批准号：
13F03403
负责人：
富永真琴
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

マキシアニオンチャネル（Maxi-Cl）は多くの動物細胞種に発現していて、細胞間シグナル分子であるATPやグルタミン酸の細胞からの放出の通路を与え、プリン作動性レセプターやグルタミン酸作動性レセプターを介して心臓や腎臓や脳における細胞間シグナリングに関与する重要分子であることが判っている。その未同定の分子同定を行うことを本研究の目的とする。Maxi-Cl機能発現度の異なる4 種のマウス由来の細胞（乳腺線維芽C127、線維肉腫L929、黒色腫B16-4A5、神経芽腫C-1300）間でのゲノムワイドマイクロアレイ解析結果と、Maxi-Clを機能的に高発現する細胞ブレッブ膜蛋白質プロテオミクス法の結果、これら両第一次候補分子群でオーバーラップするものを第２次候補とし、26遺伝子を平成25年度に選抜した。平成26年度は、まずこれらの中で膜蛋白質関連遺伝子と考えられる22遺伝子を、第三次候補分子として選択した。そして、これらの中で集団を形成している7つのアネキシンファミリーメンバーに対してsiRNAジーンサイレンシング法を適用し、パッチクランプ法によって測定されたMaxi-Cl電流の抑制を再現性よく示すものとして、アネキシンA2（Anxa2）を同定した。しかし、Maxi-Cl機能欠失C1300細胞に、Anxa2を強制発現してもMaxi-Cl活性を回復させることはできなかった。それゆえ、アネキシンA2はMaxi-Cl分子そのものではなく、そのレギュレータであることが結論された。平成27年度は、残りの15遺伝子の関与を同様にして検討した結果、ついにX遺伝子（論文未発表のためXと記入）をMaxi-Cl分子の最終候補遺伝子として得ることができた。現在、CRISPR法によるX遺伝子ノックアウト細胞を作成し、その解析によってMaxi-Cl分子の最終的同定に迫っている。

Maxi-阴离子通道 (Maxi-Cl) 在许多动物细胞类型中表达，并提供细胞间信号分子、ATP 和谷氨酸通过嘌呤能和谷氨酸受体从细胞中释放的途径。心脏、肾脏和大脑中的细胞间信号传导。这项研究的目的是识别这些未识别的分子。 4.具有不同程度的Maxi-Cl功能表达小鼠物种来源的细胞（乳腺成纤维细胞 C127、纤维肉瘤 L929、黑色素瘤 B16-4A5、神经母细胞瘤 C-1300）和功能性高度表达 Maxi-Cl 的细胞的全基因组微阵列分析结果作为泡膜蛋白蛋白质组学方法的结果，那些在这两个主要候选分子组之间重叠的基因被选为次要候选基因，2013年选出了26个基因。 2014财年，我们首先选择了22个被认为是膜蛋白相关基因的基因作为第三候选分子。然后，我们将 siRNA 基因沉默方法应用于形成其中的七个膜联蛋白家族成员，并证明了通过膜片钳方法测量的 Maxi-Cl 电流的可重复抑制。然而，在缺乏 Maxi-Cl 功能的 C1300 细胞中强制表达 Anxa2 未能恢复 Maxi-Cl 活性。因此，可以得出结论，膜联蛋白A2不是Maxi-Cl分子本身，而是其调节剂。 2015财年，我们用同样的方法调查了其余15个基因的参与情况，最终得到了X基因（因为论文尚未发表，所以输入为X）作为Maxi-Cl的最终候选基因。分子。目前，我们正在利用CRISPR方法创建X基因敲除细胞并对其进行分析，以最终鉴定Maxi-Cl分子。