Ｓ期における紫外線ＤＮＡ損傷応答に対する転写因子Ｆｏｘｏ１の新規機能の解明

阐明转录因子 Foxo1 响应 S 期紫外线 DNA 损伤的新功能

基本信息

批准号：
13J00452
负责人：
金子悠太
金额：
$ 1.92万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、Ｓ期の紫外線DNA損傷応答機構である損傷乗り越えDNA複製（TLS）における転写因子FOXO1の新規機能の解明、及び生体レベルでの機能解析を目指している。これまでに、FOXO1がS期の紫外線DNA損傷に対して保護的に働くことや、FOXO1がTLSにおける足場タンパク質RPA1と相互作用することなどを見出しており、FOXO1が転写を介さずにTLSに寄与する可能性が示唆されている。昨年度は、細胞レベルでの複製ストレス依存的な相互作用の検出と線虫におけるFOXO1とRPA1の相同遺伝子であるDAF-16とRPA-1の遺伝学的な相互作用の解析を目指し、それらの実験系の確立及び検討を行った。複製ストレス応答の評価系の確立を目指し、細胞レベルで二分子間の相互作用を検出するProximity ligation assay: PLAを用いたRPAとの相互作用解析系を確立した。実際に、複製期のDNA損傷応答因子CTF18とRPAの関連をPLAにより確認し、CTF18の複製期DNA損傷応答時特異的なRPAとの相互作用を確認した。本結果は、Molecular medicine reports 誌に受理されており、複製ストレス応答におけるCTF18の新規制御機構解明の糸口として有用な研究成果を残すことが出来た。現在は、この解析法を用い、複製期の紫外線照射後のFOXO1-RPAの相互作用解析やそれに付随する因子の同定を行っている。線虫での解析においては、RPA-1とDAF-16の遺伝学的解析を目的に、ノックダウン法によるRPA-1発現低下を誘導し、そのノックダウン効率の検証を行った。今後は、DAF-16欠損線虫における紫外線抵抗性を、rpa-1とコントロールノックダウンで比較し、遺伝学的相互作用を検証する予定である。

在本研究中，我们旨在阐明转录因子FOXO1在跨损伤DNA复制（TLS）中的新功能，TLS是S期紫外线DNA损伤的响应机制，并在生物学水平上分析其功能。到目前为止，我们发现FOXO1在S期期间对UV DNA损伤具有保护作用，并且FOXO1与TLS中的支架蛋白RPA1相互作用，这表明FOXO1在不介导转录的情况下有助于TLS的可能性。去年，我们进行了旨在检测细胞水平上的复制应激依赖性相互作用并分析DAF-16和RPA-1之间的遗传相互作用的实验，该系统是线虫中FOXO1和RPA1的同源基因。。为了建立复制应激反应的评估体系，我们建立了一种在细胞水平上检测两个分子之间相互作用的邻近连接分析（proximity ligation Assay）：使用PLA和RPA的相互作用分析系统。事实上，我们利用PLA证实了复制期DNA损伤反应因子CTF18和RPA之间的关系，并证实了CTF18与RPA之间的相互作用是复制期DNA损伤反应特有的。该结果已被《Molecular Medicine Reports》杂志接受，为我们阐明CTF18在复制应激反应中的新调控机制留下了有用的研究结果。目前，我们正在利用这种分析方法分析复制阶段紫外线照射后 FOXO1-RPA 的相互作用，并确定与之相关的因素。在秀丽隐杆线虫分析中，为了对RPA-1和DAF-16进行遗传分析，我们通过敲低方法诱导RPA-1表达减少，并验证了敲低效率。未来，我们计划将 DAF-16 缺陷线虫的紫外线抗性与 rpa-1 和对照敲低进行比较，以验证遗传相互作用。