細胞がん化の早期診断のための生物発光酵素固定フォトニック結晶の創製

创建生物发光酶固定光子晶体用于细胞癌变的早期诊断

基本信息

批准号：
13J05911
负责人：
宮下惟人
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University (2014-2015)Chiba University (2013)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

グアニン結晶板への固定化に関してはポリグルタミン酸による架橋法を試みた。純水で洗浄したグアニン結晶板に対し、ポリグルタミン酸水溶液を加え数時間静置後にルシフェラーゼ酵素を添加しさらに低温で数時間静置した。その後、遠心分離により溶液を取り除いて沈降させたグアニン結晶板をHEPESバッファで洗浄して調整を行った。このグアニン結晶板の集団に対してルシフェリン基質およびATPの混合溶液を滴下することで微弱な発光をCCD分光器で検出し、架橋でルシフェラーゼ酵素のグアニン結晶板への固定が行われたことが示唆された。しかし、酵素反応による発光強度は肉眼では確認が困難であった。原因として酵素自体の固定量が少ない、もしくは架橋固定されたことによって酵素分子の構造に変形が生じて十分な活性が獲られなかった可能性も考えられる。そこで、フレキシブルなシート型の発光チップを試作した。この発光シートの発光層の裏側にグアニン結晶の反射層を設けた2層構造により発光層の光を観察方向へと増幅させることを検討した。加えて、磁場による磁場印加による発光調整を試みた。9×9 mmの発光面を持ったフレキシブルなシート型チャンバーを試作し、酵素および発光基質溶液の流入用チューブを接続してチャンバー内での発光を観察した。2層構造のシート型チャンバーのもう一方（結晶層）には高濃度のグアニン結晶板の分散水溶液を封入し、5×5mmの永久磁石によりクロスパターンの勾配分布を持つ磁場を印加した。これにより、シート面内で勾配パターンに依存して磁場配向したグアニン結晶の数ミリ幅の局所的な光反射分布が発生し、発光層でのルシフェリンルシフェラーゼ発光分布も同様の領域内において強い輝度で観察された。（INTERMAG2015にてポスター発表）。

为了固定在鸟嘌呤晶体板上，我们尝试了使用聚谷氨酸的交联方法。将聚谷氨酸水溶液加入到用纯水洗涤的鸟嘌呤晶体板中，并将板静置数小时，然后，添加荧光素酶并将板在低温下静置数小时。然后，通过离心除去溶液，并用HEPES缓冲液洗涤沉淀的鸟嘌呤晶体板以进行调整。通过将荧光素底物和ATP的混合溶液滴到该群鸟嘌呤晶体板上，使用CCD分光计检测到微弱的发光，表明荧光素酶通过交联固定在鸟嘌呤晶体板上。然而，由于酶反应，用肉眼很难确认发光强度。可能的原因可能是酶本身固定化量少，或者是酶分子结构因交联固定化而变形，导致活性不足。因此，我们制作了柔性片状发光芯片的原型。我们研究了一种两层结构，其中在该发光片的发光层的背面设置鸟嘌呤晶体的反射层，以在观察方向上放大来自发光层的光。此外，我们尝试通过施加磁场来调节发光。我们制作了一个具有 9 x 9 mm 发光表面的柔性片状室原型，将其连接到酶和发光底物溶液的流入管，并观察了室内的发光。两层片状腔室的另一侧（晶体层）填充高浓度鸟嘌呤晶体板水分散液，并使用 5 x 5 mm 永磁体施加具有十字图案梯度分布的磁场。这根据片平面内的梯度图案在磁性取向的鸟嘌呤晶体中产生几毫米宽的局部光反射分布，并且发光层中的荧光素荧光素酶发射分布在观察到的相同区域内也具有很强的亮度。（INTERMAG2015 上的海报展示）。