ＰＨＡ重合酵素における重合能活性化の機構解明およびＰＨＡ高効率生産への応用

PHA聚合酶聚合能力激活机制的阐明及其在PHA高效生产中的应用

基本信息

批准号：
13J07410
负责人：
牛丸和乗
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ポリヒドロキシアルカン酸 (PHA) は糖や植物油、脂肪酸といったバイオマス資源から微生物合成可能な高分子材料で、熱可塑性や生分解性などの特徴を有するため、環境調和型プラスチック材料や医用材料としての利用が期待されている。申請者はPHA顆粒結合タンパク質(フェイシン、PhaP)がある種のPHA重合酵素を活性化可能であることを見出し、その活性化機構解析とPHA高生産化への応用を行った。細胞外(in vitro)実験により、重合酵素活性化がPhaP濃度依存的な効果であること、アミノ酸配列や分子量が大きく異なる他の微生物由来のPhaPでも活性化が可能であること、重合能活性化と共に重合酵素の基質特異性も変化することが見出された。また、上記の活性化機構に関して、種々のin vitro実験結果などに基づき推定される活性化機構を提案した。上記の重合酵素活性化効果が細胞内(in vivo)でも生じるかという点を、組換え大腸菌を用いたin vivo PHA生産系で評価したところ、PhaPを導入したin vivo PHA生産系ではPhaP濃度依存的にPHA蓄積が向上し、最大で4.2倍のPHA生産量向上が確認された。これらに加え、申請者の所属する研究室において見出されたPhaP変異体に関する解析を行った。この変異体は野生型のPhaP導入株に比べてPHAを高効率で生産可能であるが、その高生産化機構は不明であった。この変異体をin vitro, in vivoの両実験から評価したところ、野生型に比べPhaPの発現量が増加することでPHA高生産化が生じていることが明らかとなった。これらの結果は、PhaPの新たな機能を明らかとするのみでなく、「PhaPによる重合酵素活性化」を利用することでPHAの高効率生産が可能であることをin vitro、in vivoの両面から示した独自性の高い研究であるといえる。

聚羟基烷酸（PHA）是一种以糖、植物油、脂肪酸等生物质资源为原料，由微生物合成的高分子材料，具有热塑性和生物降解性等特性，可作为环保塑料材料和医用材料。材料。申请人发现PHA颗粒结合蛋白(phasin，PhaP)可以激活某种类型的PHA聚合酶，并分析了激活机制并将其应用于高PHA生产。通过细胞外（体外）实验，我们发现聚合酶的激活是PhaP浓度依赖性效应，来自氨基酸序列和分子量显着不同的其他微生物的PhaP的激活是可能的，并且聚合能力的激活是还发现聚合酶的底物特异性也可能发生变化。此外，关于上述激活机制，我们提出了基于各种体外实验结果估计的激活机制。我们使用重组大肠杆菌的体内PHA生产系统评估了上述聚合酶激活效果是否也发生在细胞内（体内），结果证实PHA积累得到改善，PHA产量增加高达4.2倍。除此之外，我们还对申请人实验室发现的 PhaP 突变体进行了分析。该突变体可以比引入 PhaP 的野生型菌株更高效地生产 PHA，但这种高产量的机制尚不清楚。当通过体外和体内实验评估该突变体时，发现与野生型相比，通过增加 PhaP 的表达水平来增加 PHA 产量。这些结果不仅揭示了PhaP的新功能，而且从体外和体内两个角度证明，利用“PhaP激活聚合酶”可以高效生产PHA，可以说这项研究具有很高的原创性。