無細胞翻訳系を用いたＳｅｃＹＥＧトランスロコンの機能発現メカニズムの解析

利用无细胞翻译系统分析SecYEG易位子的功能表达机制

基本信息

批准号：
13J06852
负责人：
松林英明
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までに、無細胞翻訳系によるSecYEGの再構築と、それに基づいて合成する膜タンパク質のliposome膜上でのトポロジー制御について成果をまとめ、論文発表と複数の学会での発表をすることができた。本年度は、さらに研究を発展させるべく、SecYEGの無細胞合成に必要な脂質組成の解析と、合成したSecYEGの１分子観察を行った。脂質組成の解析について、昨年度までは脂質抽出物を用いた場合でしかSecYEGの活性がみられていなかったが、脂質の脂肪酸の条件検討により合成脂質で再構成することに成功した。脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で１分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して１分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから１分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。

到去年，我们能够使用无细胞的翻译系统和基于脂质体膜上合成的膜蛋白的拓扑结构系统和拓扑控制进行重建SECYEG的结果，并在多个会议上呈现论文。为了进一步发展我们的研究，我们分析了secyeg无细胞合成所需的脂质组成，并观察到单个合成的secyeg分子。关于脂质组成的分析，直到去年，只有在使用脂质提取物时才能看到secyeg活性，但是通过检查脂质脂肪酸的条件，我们已成功地将其与合成脂质进行了重构。由于脂质提取物不适合创建巨型单层囊泡（GUV），因此可以预期，这次获得的结果可以在人工细胞系统和体外进化中具有广泛的应用。此外，去年发现的类似糖脂状的分子很困难，因为它们是少量的分子，但他们继续在Iwate University的Nishiyama的Nishiyama实验室的联合研究地点分析它们。关于Secyeg的膜渗透性，当庞培的氨基酸长度（一种分泌的底物蛋白质）缩短时，在重建系统中也检测到膜通透性的营业额。为了进行详细的动力学分析，我们与东京NOJI大学实验室合作研究了单分子观察。首先，建立了通过无细胞系统对SECY和SECE进行荧光标记的条件，并在人造脂质平面膜上重建，并使用总反射显微镜首次揭示了Secy和Sece亚基，也可以使用总反射显微镜进行观察，它们在纯脂质膜上可以稳定地存在。此外，为了观察膜渗透反应，荧光标记并观察到一个分子，并观察到一个分子，并观察到与脂质膜的非特异性结合。尽管检查了条件，但由于平面膜在显微镜上重建的不稳定性，对膜渗透反应的分析是不可能的，但是纯化和重建的复杂性表明，无细胞翻译系统对膜蛋白的有用性，很少用作单分子渗透系统。