無細胞翻訳系を用いたＳｅｃＹＥＧトランスロコンの機能発現メカニズムの解析

利用无细胞翻译系统分析SecYEG易位子的功能表达机制

基本信息

批准号：
13J06852
负责人：
松林英明
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までに、無細胞翻訳系によるSecYEGの再構築と、それに基づいて合成する膜タンパク質のliposome膜上でのトポロジー制御について成果をまとめ、論文発表と複数の学会での発表をすることができた。本年度は、さらに研究を発展させるべく、SecYEGの無細胞合成に必要な脂質組成の解析と、合成したSecYEGの１分子観察を行った。脂質組成の解析について、昨年度までは脂質抽出物を用いた場合でしかSecYEGの活性がみられていなかったが、脂質の脂肪酸の条件検討により合成脂質で再構成することに成功した。脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で１分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して１分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから１分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。

直到去年，我们已经整理出了利用无细胞翻译系统重建SecYEG以及基于此合成的膜蛋白在脂质体膜上的拓扑控制的成果，并能够发表论文并在多个学术会议上进行展示。。今年，为了进一步发展我们的研究，我们分析了无细胞合成SecYEG所需的脂质组成，并观察了合成的SecYEG的单分子。关于脂质成分的分析，截至去年，SecYEG活性仅在使用脂质提取物时观察到，但通过检查脂质的脂肪酸状况，我们成功地用合成脂质对其进行了重构。脂质提取物不适合制造巨型单层囊泡（GUV），因此这里获得的结果预计将在人工细胞系统和膜蛋白的体外进化中具有广泛的应用。此外，去年发现的类糖脂分子由于数量较少而难以分析，但正在与岩手大学西山实验室合作继续对其进行分析。关于SecYEG的膜渗透活性，当分泌蛋白底物pOmpA的氨基酸长度缩短时，在重构系统中也检测到膜渗透周转。为了进行详细的动力学分析，我们与东京大学野寺实验室合作进行了单分子观察。首先，我们建立了在无细胞系统中荧光标记SecY和SecE并在人工脂质平板膜上重建的条件，并使用全内反射显微镜对其进行观察，首次发现其可以在其上稳定地扩散。纯脂质膜。此外，为了观察膜渗透反应，对pOmpA进行荧光标记并进行单分子观察，但观察到与脂质膜的非特异性结合。尽管我们研究了条件，但由于在显微镜上重建的平面膜的不稳定性，我们无法分析膜渗透反应，我们获得的结果证明了无细胞翻译系统对蛋白质的有用性。