新規光駆動ナトリウムポンプのイオン識別機構の解明と光操作技術への応用

新型光驱动钠泵离子识别机制的阐明及其在光操控技术中的应用

基本信息

批准号：
14J40214
负责人：
吉住玲
金额：
$ 3.16万
依托单位：
Nagoya Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、2013年に発見されたばかりで分子メカニズムは不明な点が多い、新規光駆動ナトリウムポンプのイオン識別機構を明らかにしようとしている。(1)分子レベルでの解析：BRにおいて機能に重要なD85とD96が、KR2ではそれぞれN112、Q123という特異的な配列になっている。2015年に解かれたKR2の結晶構造より、我々はD116の配向が変化し、Na+の輸送経路を形成するフリップモデルを提唱した。モデルにおいて重要なN112に着目し、19種の変異体を作製、ポンプ活性を測定した。19種はWTと同様のNa+/H+ハイブリッドポンプ(N112D,G,S,T)、H+ポンプ(N112A,C,P,V,E,Q,I,L,M,F,W)、ポンプ機能なし(N112H,K,Y,R)の3グループに分けられた。N112はNa+とH+のイオン選択性やポンプ機能そのものに、重要な役割を担っていることが明らかとなった。(2)細胞レベルでの解析：KR2の保持菌Krokinobacter eikastusの近縁種Nonlabens dokdonesis DSW-6はProteorhodopsin(PR)とNaRの二つのロドプシン遺伝子を有している。ポンプ活性を測定すると、光駆動H+ポンプ活性が検出され、その活性は生育時期によって変化していた。この変化がPRの発現量やPR分子における比活性によるのかを明らかにするため、PRの発現量と光反応サイクルを測定したところ、どちらも生育時期に依存せず一定であった。これは、PRがN. dokdonesis DSW-6において恒常的に発現し、一定の活性を保持することを示している。一方で、N. dokdonesis DSW-6細胞全体における光駆動H+ポンプ活性が変化することは、PR分子と共役して働く他のtransporterがある可能性が考えらえる。

本研究旨在阐明新型光驱动钠泵的离子识别机制，该钠泵于 2013 年才被发现，其分子机制目前尚不清楚。 (1)分子水平分析：在BR中发挥重要功能的D85和D96分别具有KR2中N112和Q123的特异序列。基于2015年解决的KR2晶体结构，我们提出了一个翻转模型，其中D116的取向发生变化并形成Na+传输路径。我们以模型中重要的 N112 为重点，创建了 19 个突变体并测量了它们的泵活性。 19种型号具有相同的Na+/H+混合泵（N112D、G、S、T）、H+泵（N112A、C、P、V、E、Q、I、L、M、F、W），泵功能与WT相同它们被分为 3 组：无（N112H、K、Y、R）。很明显，N112 在 Na+ 和 H+ 的离子选择性以及泵功能本身中发挥着重要作用。 (2)细胞水平分析：Nonlabens dokdonesis DSW-6是KR2载体Krokinobacter eikastus的近亲，具有两个视紫红质基因，Proteorhodopsin(PR)和NaR。当测量泵活性时，检测到光驱动的H+泵活性，并且该活性根据生长季节而变化。为了弄清楚这种变化是由于PR表达水平还是PR分子的比活性引起的，我们测量了PR表达水平和光反应周期，发现无论生长季节如何，两者都保持恒定。这表明PR在N. dokdonesis DSW-6中组成型表达并保持恒定的活性。另一方面，整个 N. dokdonesis DSW-6 细胞中光驱动的 H+ 泵活性的变化表明可能还有其他转运蛋白与 PR 分子协同工作。