Regulation of oncogenic RAS-induced endoplasmic reticulum stress response by zinc signaling

通过锌信号调节致癌 RAS 诱导的内质网应激反应

基本信息

批准号：
22K11710
负责人：
枝松裕紀
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本年度は、まず、RASシグナルによる小胞体ストレスセンサー分子IRE1の活性化と、それに対する細胞内亜鉛の影響を検討した。活性型変異体Hras（HrasG12V）を誘導発現するラット胎児線維芽細胞株Rat-1細胞由来の細胞（Rat-1RasVal細胞）において、IRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングがHrasG12V発現により誘導されることを確認した。また、HrasG12V発現によりIRE1のタンパク質の量が増加することも見出した。これらHrasG12V発現が引き起こすIRE1の変化は、MEK/ERK経路を介していることを阻害剤実験で明らかにした。そこで、IRE1の活性と相関し得るリン酸化の検出をphostag法で試みたところ、HrasG12V発現でIRE1のリン酸化が著しく亢進することがわかった。しかし、当初期待した亜鉛依存的なリン酸化については、phostag法の条件を様々に変えてはみたが現時点では検出されていない。またIRE1タンパク質の量の増加についても、プロテアソーム阻害剤などを用いて検討したが、HrasG12V発現や亜鉛濃度による影響は観察されなかった。そこで方針を変え、HrasG12V誘導発現や亜鉛欠乏による細胞死応答が生じないマウス胎児線維芽細胞株3T3細胞由来の細胞（3T3RasVal細胞）で、同様の解析を試みた。その結果、3T3RasVal細胞では、HrasG12V発現ではIRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングが誘導されないことがわかった。以上から、HrasG12VによるMEK/ERK依存的IRE1活性化には、Rat-1にはあるが3T3にはない機構が関与すると考えられた。また、Rat-1RasVal細胞を用いた解析の過程で、培地への亜鉛添加とHrasG12V発現とに依存して変化する新たなシグナル系を見出した。

今年，我们首先检查了通过RAS信号和细胞内锌在其上的影响内质网应力传感器分子IRE1的激活。我们证实，XBP1的IRE1激活依赖性非典型剪接是由源自大鼠胎儿成纤维成纤维细胞细胞系Rat-1细胞（大鼠-1RASVAL细胞）的细胞中的HRASG12V表达诱导的，从而诱导活性突变突变体HRAS（HRASG12V）。还发现HRASG12V表达增加了IRE1蛋白的量。抑制剂实验表明，由HRASG12V表达引起的IRE1的变化是由MEK/ERK途径介导的。因此，当我们尝试检测可能使用Phostag方法与IRE1活性相关的磷酸化时，我们发现HRASG12V表达显着增强了IRE1的磷酸化。然而，在Phostag方法的各种条件下，对锌依赖性磷酸化的初始期望已改变，但目前尚未检测到。此外，还使用蛋白酶体抑制剂研究了IRE1蛋白量的增加，但由于HRASG12V表达或锌浓度未观察到影响。因此，我们改变了政策，并试图对源自小鼠胎儿成纤维细胞系的3T3细胞（3T3RASVAL细胞）的细胞进行类似的分析，这些细胞不会产生HRASG12V诱导的表达或由于锌缺乏引起的细胞死亡反应。结果表明，HRASG12V表达不会诱导3T3RASVAL细胞中XBP1的IRE1激活依赖性非典型剪接。从以上，人们认为HRASG12V的MEK/ERK依赖性IRE1激活中存在于Rat-1中但不存在3T3的机制。此外，在使用Rat-1rasval细胞的分析过程中，我们发现了一个新的信号系统，该系统根据向培养基中添加锌和HRASG12V的表达而变化。