核内チロシンリン酸化シグナルによるクロマチン構造制御メカニズムの解明

阐明核酪氨酸磷酸化信号控制染色质结构的机制

• 批准号: 14J04367
• 负责人: 久保田 翔
• 金额: $ 1.39万
• 依托单位: Kumamoto University (2015)Chiba University (2014)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J04367/
• 关键词: クロマチン; 核マトリクス; クロマチン構造変換; KAP1; Src; AKAP8; ヘテロクロマチン; 分子生物学; シグナル伝達; ホスホプロテオミクス; 薬学; 細胞; チロシンキナーゼ

本年度はin vivo, in vitroの両方向からの解析を行なった。in vivoの解析では私が以前、核内チロシンリン酸化基質として同定したKAP1のノックアウトマウスを用いた解析を行なった。具体的には、造血幹細胞の分化を解析する系を利用して調べた。造血幹細胞の増殖分化においてKAP1はおよびチロシンリン酸化シグナルは重要な役割をもっている。KAP1ノックアウトマウスの造血幹細胞をセルソーターを用いて分取し、野生型のKAP1とチロシンリン酸化されない変異体をレトロウィルスベクターのインフェクションによって発現させ、レシピエントマウスに移植し、その分化増殖への影響を解析した。In vitroの解析では、核内チロシン基質群の中でヒストン修飾に関わる分子として A-kinase anchoring protein 8 (AKAP8) に着目した。AKAP8はクロマチンや核マトリクスに結合し、ヒストン脱アセチル化酵素であるhistone deacetylase 3 (HDAC3) などの分子のリクルートに関わっていることが知られている。昨年度の解析からAKAP8はチロシンキナーゼによってチロシンリン酸化されることで、クロマチンや核マトリクスとの結合が弱められることが示唆された。AKAP8のチロシンリン酸化による機能変化を解析するために、私はAKAP8の中でチロシンリン酸化されるチロシン残基をチロシンリン酸化されないフェニルアラニンに置換した変異体の作製を行なった。複数の部位のチロシンを置換した変異体では結合の変化がキャンセル出来た。このことから、AKAP8の結合の変化は一か所のチロシン残基のリン酸化によって制御されているのではなく、複数の部位のチロシンリン酸化によって制御されていることがわかった。

今年，我们进行了体内和体外分析。对于体内分析，我们使用了 KAP1 基因敲除小鼠，我之前已将其鉴定为核酪氨酸磷酸化底物。具体来说，我们使用分析造血干细胞分化的系统进行了研究。 KAP1和酪氨酸磷酸化信号在造血干细胞的增殖和分化中发挥重要作用。使用细胞分选仪对来自KAP1敲除小鼠的造血干细胞进行分选，通过逆转录病毒载体感染表达野生型KAP1和非酪氨酸磷酸化的突变体，并将其移植到受体小鼠中以检查其对分化和增殖的影响。体外分析重点关注 A 激酶锚定蛋白 8 (AKAP8) 作为参与核酪氨酸底物组蛋白修饰的分子。 AKAP8 与染色质和核基质结合，已知参与组蛋白脱乙酰酶 3 (HDAC3) 等分子的募集。去年的分析表明，AKAP8 被酪氨酸激酶磷酸化，削弱了其与染色质和核基质的结合。为了分析AKAP8酪氨酸磷酸化引起的功能变化，我创建了AKAP8的突变体，其中酪氨酸磷酸化的酪氨酸残基被未酪氨酸磷酸化的苯丙氨酸取代。在酪氨酸在多个位点被取代的突变体中，结合的变化可以被取消。这表明 AKAP8 结合的变化不是由单个酪氨酸残基的磷酸化调节的，而是由多个位点的酪氨酸磷酸化调节的。

项目成果

Role for Tyrosine Phosphorylation of A-kinase Anchoring Protein 8 (AKAP8) in its Dissociation from Chromatin and the Nuclear Matrix

A-激酶锚定蛋白 8 (AKAP8) 酪氨酸磷酸化在染色质和核基质解离中的作用

• DOI: 10.1074/jbc.m115.643882
• 发表时间: 2015
• 影响因子: 4.8
• 作者: Kubota S; Morii M; Yuki R; Yamaguchi N; Yamaguchi H; Aoyama K; Kuga T; Tomonaga T; Yamaguchi N.
• 通讯作者: Yamaguchi N.

Lyn tyrosine kinase promotes silencing of ATM-dependent checkpoint signaling during recovery from DNA double-strand breaks.

Lyn 酪氨酸激酶在 DNA 双链断裂恢复过程中促进 ATM 依赖性检查点信号的沉默。

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.08.113
• 发表时间: 2014
• 作者: Fukumoto; Y.; Kuki; K.; Morii; M.; Miura; T.; Honda; T.; Ishibashi; K.; Hasegawa; H.; Kubota; S.; Ide; Y.; Yamaguchi; N.;Yamaguchi; N.
• 通讯作者: N.

核内チロシンリン酸化を介したクロマチン構造変換の分子メカニズムの解析

核酪氨酸磷酸化染色质结构转变的分子机制分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 久保田 翔; 森井真理子; 幸 龍三郎; 山口弘美; 山口憲孝; 青山和正; 久家貴寿; 朝長 毅; 山口直人.
• 通讯作者: 山口直人.

Overexpression of Zinc-finger protein 777 (ZNF777) inhibits proliferation at low cell density through down-regulation of FAM129A.

锌指蛋白 777 (ZNF777) 的过表达通过下调 FAM129A 抑制低细胞密度下的增殖。

• DOI: 10.1002/jcb.25046
• 发表时间: 2015
• 作者: Yuki; R.; Aoyama; K.; Kubota; S.; Yamaguchi; N.;Yamaguchi; N.
• 通讯作者: N.

Src型チロシンキナーゼによるBaxを介したアポトーシス誘導の制御.

Src 型酪氨酸激酶对 Bax 介导的细胞凋亡诱导的调节。

• 发表时间: 2015
• 作者: 森井真理子; 久保田 翔; 本田拓也; 青山和正; 幸 龍三郎; 米谷詩織; 山口憲孝; 山口直人.
• 通讯作者: 山口直人.