新規ナノ膜デバイスを用いたプロトン受け渡し経路の研究

利用新型纳米膜器件进行质子传输路径研究

基本信息

批准号：
14F04383
负责人：
野地博行
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14F04383/
关键词：
ATP合成酵素 H+輸送一分子生物物理学電子伝達系プロトン輸送

项目摘要

H27年度の実績概要として以下の3点があげられる。1点目は、好アルカリ菌(以下、TA2.A1)由来のATP合成酵素のF1部(以下、TA2. F1)の一分子回転計測である。F1部はATP合成反応における触媒部位を持つため、その基本特性の詳細な解析(速度論的パラメーターや回転トルク等)は重要な意味を持つ。まず、一分子回転計測で使用する変異体の最適化を行った。次に、顕微鏡下で200 nmのビーズを用いた回転計測からTA2. F1のATP加水分解反応における詳細な基本特性の解析を行った。最大回転速度は約6.5Hz、Kmは2.7 uM、ATP結合速度は9.9x10^6/Msであった。また、TA2. F1は他生物由来と比較して大きい回転トルク(53 pN nm)を発生する事から、他生物由来より強固な化学力学共役機構を持つことが示唆された。これらの結果は原著論文として出版された。2点目は、ATP合成酵素にH+駆動力を提供するcytochrme bo3複合体の生化学機能評価である。cytochrme bo3を再構成した人工膜小胞を用いて、cytochrme bo3の持つユビキノンの酸化活性に共役したH+輸送活性を評価できる電気計測系を開発した。これによりcytochrome bo3の持つH+輸送の詳細な解析を行った。現在、一分子cytochrme bo3のH+輸送計測を試みており、より詳細な輸送機構の解明を行う。3点目は、病原菌(以下、Fuso)由来のF1の一分子回転計測である。発現系・回転計測系を構築し一分子回転計測を行ったところ、他生物種由来よりも極めて速い~1000Hzの速度で回転することがわかった。さらに、FusoF1は極度に阻害状態に陥ることがわかった。今後更なる解析を行なっていく。

总结2017财年我们取得的成绩，可以归纳为以下三点。第一点是来自嗜碱性细菌的ATP合成酶(以下称为TA2.A1)的F1部分(以下称为TA2.F1)的单分子旋转测定。由于F1部分具有ATP合成反应的催化位点，因此详细分析其基本性质（动力学参数、旋转扭矩等）具有重要意义。首先，我们优化了单分子旋转测量中使用的突变体。接下来，我们通过在显微镜下使用200 nm珠子进行旋转测量，对TA2.F1的ATP水解反应的基本特征进行了详细分析。最大旋转速度约为6.5Hz，Km为2.7uM，ATP结合率为9.9x10^6/Ms。此外，TA2.F1比其他生物体产生了更大的旋转扭矩（53 pN nm），这表明它比其他生物体具有更强的化学机械耦合机制。这些结果作为原始论文发表。第二点是评估细胞色素bo3复合物的生化功能，该复合物为ATP合酶提供H+动力。使用重构细胞色素 bo3 的人工膜囊泡，我们开发了一种电测量系统，可以评估与细胞色素 bo3 的泛醌氧化活性耦合的 H+ 转运活性。这使我们能够对细胞色素 bo3 的 H+ 转运进行详细分析。目前，我们正在尝试测量单分子细胞色素bo3的H+转运，并将更详细地阐明转运机制。第三点是源自病原菌的F1（以下简称Fuso）的单分子旋转测量。当我们构建表达系统和旋转测量系统并测量单分子旋转时，我们发现它的旋转速度约为1000Hz，这比其他生物物种的旋转速度要快得多。此外，发现 FusoF1 受到严重抑制。未来我们将进行进一步的分析。