ALSモデルカニクイザルを用いた超早期病態解明および治療戦略構築

ALS模型食蟹猴超早期病理阐明及治疗策略制定

基本信息

批准号：
22K19359
负责人：
等誠司
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Shiga University of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)は運動ニューロンが選択的に変性・脱落する進行性の神経難病で、根本的治療法が存在しないため、患者の多くは数年で死に至る。我が国では約9000人のALS患者が存在すると言われ、その約１割は家族性と考えられている。家族性ALS責任遺伝子の１つであるFused in sarcoma（FUS）遺伝子に変異をもつALS患者は、若齢発症が特徴で進行が速いケースが多い。本研究は、ヒトと同じ運動神経系の構造をもつ旧世界ザルの１種であるカニクイザルを用いてALSモデルサルを作製し、ヒトでは解析不可能な発症超早期や未発症時期の運動ニューロンの病態を明らかにし、ALS発症超初期の病態に基づく新規診断・治療法の開発を目指す。これまでに、若年発症急速進行性のALSを引き起こすヒトFUS-P525L変異遺伝子をカニクイザル受精卵に導入したトランスジェニックカニクイザルの作出に成功しているので、令和4年度はエクソン14を欠失するFUS-G466VfsX14と同様の効果を生む遺伝子改変サルの作出を行った。カニクイザルFUS遺伝子のエクソン14の両側（イントロン13および14内）にCRISPR/Cas9の標的配列を複数設定した。カニクイザルES細胞に、標的配列に対するガイドRNAおよびCas9を発現するプラスミドをレポータープラスミドとともに遺伝子導入し、最も切断効率が良かった標的配列のペアを選別した。次いで、選択したガイドRNAとCas9タンパク質を人工合成してカニクイザル受精卵に導入し、胚盤胞期まで培養した後に、仮親の子宮に移植した。現在のところ、2頭の産児を得て表現型の有無を観察中である。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种无法治愈的进行性神经系统疾病，其运动神经元选择性退化和脱落。由于没有根本治疗方法，许多患者在几年内死亡。据说日本大约有9000名ALS患者，其中大约10%被认为是家族性的。融合肉瘤 (FUS) 基因（导致家族性 ALS 的基因之一）发生突变的 ALS 患者具有发病早且进展迅速的特点。在这项研究中，我们使用食蟹猴（一种与人类具有相同运动神经系统结构的旧大陆猴子）创建了 ALS 模型猴，并在发病的早期阶段和症状前阶段发育出了运动神经元，这是不可能的。我们的目标是阐明 ALS 的病理生理学，并根据 ALS 发病早期的病理状况开发新的诊断和治疗方法。到目前为止，我们已经通过将人类 FUS-P525L 突变基因引入受精的食蟹猴卵中，成功地培育出转基因食蟹猴，这种突变基因会导致幼年发病、快速进展的 ALS，我们创造了一种转基因食蟹猴，它能产生与 G466VfsX14 相同的效果。在食蟹猴FUS基因的第14号外显子两侧（第13号和第14号内含子内）设置了多个CRISPR/Cas9靶序列。将目标序列的指导RNA和表达Cas9的质粒与报告质粒一起引入食蟹猴ES细胞中，并选择具有最高切割效率的一对目标序列。接下来，人工合成选定的指导RNA和Cas9蛋白，将其导入受精的食蟹猴卵中，培养至囊胚阶段，然后植入养父母的子宫中。目前，我们已经获得了两个后代，正在观察该表型的有无。