試験管内転写tRNAを用いた再構成型酵母翻訳系による非天然アミノ酸導入システム

使用体外转录的 tRNA 的重组酵母翻译系统的非天然氨基酸引入系统

基本信息

批准号：
22K19264
负责人：
富田野乃
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19264/
关键词：
無細胞翻訳系非天然アミノ酸酵母試験管内転写tRNA

项目摘要

本研究では、近年申請者が構築した試験管内転写tRNA(iVT tRNA)を用いた再構成型酵母翻訳系を利用し、高分子タンパク質内部に複数種類の非天然アミノ酸を同時に導入できるシステムを確立する。当該酵母翻訳系は、21種類のiVT tRNAによって構成されており、終止コドンの他、計34種類のセンスコドンがアミノ酸を指定しない空コドンとなる。これら空コドンに非天然アミノ酸を割り当てることにより、異なる種類の非天然アミノ酸をタンパク質の複数箇所に導入できる筈である。当該年度は、モデルタンパク質(nLuc)へ非天然アミノ酸を導入し、導入効率のコドン依存性、非天然アミノ酸の種類依存性、を評価した。1. 導入効率のコドン依存性の解析はじめに、UAG終止コドンと3種の空コドン(AGC、AGG、UUG)への非天然アミノ酸(D-Phe)の導入効率を解析した。D-PheはフレキシザイムによりiVT tRNACysにチャージさせた。UAG終止コドンではeRF1非存在下においてのみD-Pheを導入できた。AGG空コドンではeRF1存在下でもD-Pheを導入できた。AGCとUUG空コドンでは何らかの天然アミノ酸も誤導入されることが示された。未修飾iVT tRNAは、AGCやUUGなど特定の空コドンにおいて誤読をおこすことが明らかとなった。2. 非天然アミノ酸の種類依存性SPIEDACクリックケミストリーに対応する非天然アミノ酸TCO*Lysの導入効率を評価した。TCO*Lysはメタン生成古細菌由来PylRSを利用して　iVT tRNAPylにチャージさせた。TCO*LysはUAG終止コドンおよび、AGGや AGC、UUG空コドンにおいてeRF1存在下で導入された。従来eRF1より強く終止コドンに結合できるtRNAは知られていなかったが、tRNAPyl が極めて強いコドン結合能を有することを見出した。

在这项研究中，我们将建立一个系统，该系统允许通过使用体外转录tRNA（IVT tRNA）使用由申请人构建的体外转录tRNA（IVT tRNA）同时引入聚合物蛋白的多种类型的非天然氨基酸。酵母翻译系统由21种类型的IVT TRNA组成，除了终止密码子外，总共34种感觉密码子是未指定氨基酸的空密码子。通过将非天然氨基酸分配给这些空代码子，应在蛋白质的多个位置引入不同类型的非天然氨基酸。在今年，将非天然氨基酸引入模型蛋白（NLUC）中，并评估转移效率的密码子依赖性和非天然氨基酸的类型依赖性。 1。对引入效率引入的密码子依赖性的分析，对UAG终止密码子的引入不自然氨基酸（D-PHE）的效率和三个空的密码子（AGC，AGG和UUG）进行了分析。使用Flexizyme将D-PHE收取到IVT Trnacys。 UAG终止密码子只能在没有ERF1的情况下引入D-Phe。即使在ERF1存在的情况下，也可以引入D-PHE。已经表明，在AGC和UUG空密码子中也误导了一些天然氨基酸。已经揭示了未修改的IVT TRNA会导致某些空的密码子（例如AGC和UUG）误读。 2。我们评估了引入非天然氨基酸TCO*LYS的效率，该氨基酸TCO*LYS对应于非天然氨基酸的类型依赖性SPIEDAC点击化学。使用源自甲烷古细菌的塔，将TCO*LYS充电至IVT Trnapyl。在UAG终止密码子和AGG，AGC和UUG空的代码子的存在下引入了TCO*LYS。从传统上讲，没有能够结合与ERF1更强的停止密码子结合的tRNA，但发现trnapyl具有极强的密码子结合能力。