Establishment of a natural rubber synthesis system using undifferentiated rubber tree cultured cells

利用未分化橡胶树培养细胞建立天然橡胶合成体系

• 批准号: 22K19883
• 负责人: 栗原 恵美子
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19883/
• 关键词: ケミカルバイオロジー; メタボローム; 天然ゴム; シングルセルメタボローム; 培養細胞

本研究では,未分化なゴムノキの培養細胞に対して,低分子化合物処理とゴム合成に必須な遺伝子の導入を行っていき,対応する細胞内代謝物質プロファイルを取得することで未分化培養細胞内にゴム粒子を誘導することを試みることを目的としている。これまでに低分子化合物の候補としてはA2を選抜している.A2の作用機構を推定するためにA2処理時のトランスクリプトームおよびメタボローム解析を行ってきたが,より詳細なA2の作用について検討するために,今年度はA2処理時のプロテオーム解析を行い，現在データを解析している。ゴム合成関連遺伝子<I>CPT,CPTL,REF,SRPP</I>にそれぞれ蛍光タンパク質遺伝子を融合させたものをパーティクルガン法で遺伝子導入し、それぞれのタンパク質の局在および挙動を解析した．小胞体との共局在を確認するためにHDEL配列に蛍光タンパク質を融合させたコンストラクトとCPT1をパーティクルガン法で同時に細胞に導入発現させたところ，局在が一致していた．よってゴム培養細胞においてCPT1は小胞体に局在している可能性が示唆された．並行して、ゴムゲノムデータベースのアップデートにより、CPTLの配列がこれまで扱っていた配列と異なることが明らかになった．そこで，新規配列に蛍光タンパク質遺伝子を融合させたコンストラクトを作成した．再度，局在と挙動を観察した結果，CPT1とCPTLだけを導入した細胞においては時間経過に伴いCPTとCPTLの局在が一致しなくなるのに対し，REFを追加して導入するとCPT1,CPTLの局在が小胞体にとどまることがが分かった．当初の計画ではこの遺伝子導入した細胞のシングルセルメタボロームを行う予定だったが，必要量のサンプルが取得できないため，今年度はゴム培養細胞の恒常的な形質転換の確立を試みる予定である．

在本研究中，我们将对未分化的橡胶树培养细胞进行低分子化合物处理，并引入橡胶合成所必需的基因，并获得相应的细胞内代谢谱，目的是尝试诱导橡胶颗粒产生橡胶颗粒。到目前为止，A2已被选为低分子量化合物的候选者。为了估计A2的作用机制，我们在A2治疗期间进行了转录组和代谢组分析，但我们也研究了A2的作用为了更详细地做到这一点，我们在今年 A2 治疗期间进行了蛋白质组分析，目前正在分析数据。我们使用粒子枪方法引入了与橡胶合成相关基因<I>CPT、CPTL、REF和SRPP</I>融合的荧光蛋白基因，并分析了每种蛋白的定位和行为。为了确认与内质网的共定位，利用粒子枪法将荧光蛋白与HDEL序列融合的构建体和CPT1同时导入细胞内，定位一致。因此，有人认为CPT1可能定位于培养的橡胶细胞的内质网中。同时，橡胶基因组数据库的更新显示CPTL的序列与迄今为止处理的序列不同。因此，我们创建了一个构建体，其中荧光蛋白基因与新序列融合。再次观察定位和行为的结果是，我们发现在仅引入CPT1和CPTL的细胞中，CPT和CPTL的定位随着时间的推移变得不一致，而当另外引入REF时，CPT1和CPTL的定位变得不一致不同的是，发现定位仍然在内质网中。最初的计划是对导入该基因的细胞进行单细胞代谢组分析，但由于我们无法获得所需数量的样本，因此我们计划今年尝试建立培养橡胶细胞的永久转化。

项目成果

Single cell analysis for elucidation of natural rubber biosynthesis mechanism using rubber suspension cells

使用橡胶悬浮细胞进行单细胞分析阐明天然橡胶生物合成机制

• 发表时间: 2023
• 作者: Emiko Okubo-Kurihara;Emi Osada,Yuko Makita;Mika Kawashima;Hiroko Tsuchida;Ayato Sato;Naoya Kadofusa;Nanako Katou;Mayuko Sato;Mayumi Wakazaki;Kiminori Toyooka;Yuki Hamamura;MinamiMatsui
• 通讯作者: MinamiMatsui

ゴム培養細胞を用いたゴム生合成システムの解析

利用培养橡胶细胞分析橡胶生物合成系统

• 发表时间: 2022
• 作者: 栗原（大窪）恵美子;長田恵美,蒔田由布子;川島美香;栗原志夫;土田博子;佐藤綾人;角房直哉;加藤菜々子;浜村有希;佐藤繭子;若崎真由美;豊岡公徳;松井南1
• 通讯作者: 松井南1