金魚免疫系×ヒトモデル化血液脳関門チップで変革する中枢送達型抗体開発

利用金鱼免疫系统x人体模型血脑屏障芯片开发集中递送抗体

基本信息

批准号：
22K19493
负责人：
立川正憲
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19493/
关键词：
血液脳関門抗体エンドサイトーシス

项目摘要

核酸やタンパク質を新たなモダリティーとする高分子薬を中枢疾患治療薬として開発する場合、ヒト血液脳関門(Blood-Brain Barrier, BBB)の突破戦略の構築は重要な課題である。近年、BBB受容体に結合する抗体と薬物との複合体を創製し、受容体介在型トランスサイトーシス機構(Receptor-Mediated Transcytosis, RMT)を利用してBBB突破を図る技術が注目されている。一方で、BBBにおける標的受容体は限定的であり、新たな受容体介在型トランスサイトーシスの分子実体の同定が必要である。本研究では、ヒト脳血管内皮細胞の細胞膜画分に対する抗体を創製し、BBBにおいてRMTの第一ステップとなる受容体介在型エンドサイトーシス機能を有する受容体を同定することを目的とした。ヒトBBBモデルとして脳微小血管内皮細胞(hCMEC/D3細胞)の細胞膜画分を抗原としてマウスに免疫し、ポリクローナル抗体を含む血清を取得した。免疫沈降とプロテオミクスを組み合わせた手法を用い、hCMEC/D3細胞の細胞膜タンパク質に対する抗体と結合する受容体タンパク質を同定した。同定した受容体の介在型エンドサイトーシス機能は、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体の内皮細胞への内在化を検出することで評価した。その結果、抗体に結合するhCMEC/D3細胞の膜タンパク質として、既知のトランスフェリン受容体を含めて新規分子を同定した。同定された分子に対するモノクローナル抗体は、hCMEC/D3細胞へ内在化活性を示し、細胞内において粒子状のシグナルが検出された。同分子をノックダウンしたhCMEC/D3細胞では、抗体の内在化活性が有意に低下した。以上から、BBBにおいて介在型エンドサイトーシス機能を有する受容体の同定に至った。

在开发利用核酸或蛋白质作为治疗中枢性疾病的新模式的大分子药物时，建立突破人类血脑屏障（BBB）的策略是一个重要问题。近年来，一种在抗体和药物之间形成复合物并与 BBB 受体结合并利用受体介导的转胞吞作用 (RMT) 机制穿过 BBB 的技术引起了人们的关注。另一方面，血脑屏障中的靶受体是有限的，有必要鉴定新的受体介导的转胞吞作用的分子实体。在这项研究中，我们创建了针对人脑血管内皮细胞细胞膜部分的抗体，旨在识别具有受体介导的内吞功能的受体，这是BBB RMT的第一步。作为人BBB模型，以脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3细胞)的细胞膜部分作为抗原免疫小鼠，获得含有多克隆抗体的血清。使用免疫沉淀和蛋白质组学相结合的方法，我们鉴定了与 hCMEC/D3 细胞细胞膜蛋白抗体结合的受体蛋白。通过检测针对靶蛋白的单克隆抗体内化到内皮细胞中来评估所识别的受体介导的内吞功能。结果，我们鉴定了新分子，包括已知的转铁蛋白受体，作为与抗体结合的 hCMEC/D3 细胞的膜蛋白。针对所识别分子的单克隆抗体显示出 hCMEC/D3 细胞内化活性，并且在细胞内检测到颗粒信号。在相同分子被敲除的 hCMEC/D3 细胞中，抗体内化活性显着降低。基于上述，我们鉴定了一个具有BBB介导的内吞功能的受体。

项目成果

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专利数量（0）

ヒト血液脳関門-Blood-Brain Barrier (BBB)-を知る、創る、操る：物流システムの解明からHuman BBB on-a-Chipへの展開

了解、创建和操纵人类血脑屏障 (BBB)：从了解物流系统到开发人类 BBB 芯片

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Teruya Kenta;Oguma Ayumi;Takahashi Satoko;Watanabe-Matsui Miki;Tsuji-Kawahara Sachiyo;Miyazawa Masaaki;Doh-ura Katsumi;立川正憲
通讯作者：
立川正憲

抗ヒト脳微小血管内皮細胞抗体の標的受容体の探索

寻找抗人脑微血管内皮细胞抗体的靶受体