アポトーシス発現機序の分子病理学的解析

细胞凋亡表达机制的分子病理学分析

基本信息

批准号：
09670231
负责人：
松浦恵子
金额：
$ 1.92万
依托单位：
大分医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09670231/
关键词：
アポトーシス Fas Bcl-2 ICE C-jun p53 抗Fas P815 セラマイドトランスフェクション熱ショック C-Jum

项目摘要

1. FasTfマウス肥満細胞株P815(P815Fas)に及ぼす細胞周期及び薬剤の作用機序検討:Fas遺伝子をP815細胞にTfしFasを強く発現するP815Fas細胞株を樹立した。P815Fas細胞は抗Fas抗体の刺激によりG2期の細胞が減少し、死細胞が増加する。Apo細胞はtime-dependentに増加し、2時間で40%に達する特有の性質を明らかにした。nocodazol(NZ)でP815Fas細胞を処理すると抗Fas抗体によるApoが阻止されることも確認した。しかし、bleomycin(BM)のApoではG2細胞の増加が起こり、NZにより阻止されないことも観察した。2. P815Fasに及ぼすApo刺激条件の検討:BM(0.3U/ml)、抗Fas(Jo0.1μg/ml)、C2-ceramide(CM)(10μM in 0.5%FCS)、menadione(5μM in 0.5%FCS)、熱ショック(45C 30min)、CCCP(50μM)、stauromycin(0.05μM)、genistein(10μg/ml)でApo誘導可能であることを明らかにした。3. P815FasのApoに及ぼす諸因子の効果の検討:1)諸Tf細胞による抑制:APO抑制遺伝子bcl-2およびbclxL、p53のdominant negative mutant minip53,ストレス経路で最終的にc-Junの燐酸化に関与するSEKなどをP815Fas細胞にダブルTfし、stable cloneを樹立した。bc1-2およびbclx Lでは抗Fas抗体におけるApoが全く阻止されないが、minip53ではG2細胞の減少は少なくなり、Apoは強く阻止される成績を得た。2)ペプチド(P)による抑制:Z-VADで300μMおよびDEVDで300μM各3時間で抗FasにおけるApoが強く阻止されるが、YVADで600μM、3時間ではごく軽度の阻止に留まることを観察した。3)P分解活性:抗Fas刺激ではDEVDの分解が強く起こるが、YVDAの分解は見られないこと、いっぽう、BMやCMでは分解活性が見られないことを確認した。4)CPP32(apopain)の分解活性:抗Fas刺激とBMおよびCM刺激では前者が強い分解活性を示すが、後者には全く活性が見られない成績を得た。5)C-Junの燐酸化:抗Fas刺激では燐酸化は殆ど見られないが、CMではとBMおよびCMや熱刺激では強い燐酸化が見られることを観察した。6)p53、p21およびbclxの集積:抗Fas抗体刺激ではp53の変化は見られないこと、p21は減少し、bclxは増加すること、いっぽう、BMおよびCMでは抗Fas抗体刺激ではp53およびp21の増加が見られ、bclxには変化が見られないことを観察した。4. イースト系における検討:bcl-2やICEが細胞周期やmutationに関与する可能性を検討するためにS.cervisiaeにbcl-2あるいはICEをTfし、0-12.5Kradのγ線照射によりG1,S,G2/M期の細胞数の割合を形態の違いで計数した。また、γ線照射により生じるmutationの頻度をminimal plate上のコロニーの数で比較した。しかし、有意の成果はえられなかった。5. その他:P815細胞にIPTG-inducibleな条件下にRb,アンチセンスRbを電気穿孔法でTfし、細胞増殖の違いやDNA障害因子によるAPOの程度を検討中である。

1.FasTf小鼠肥大细胞系P815（P815Fas）的细胞周期和药物作用机制研究：将Fas基因注射到P815细胞中，建立强表达Fas的P815Fas细胞系。在 P815Fas 细胞中，用抗 Fas 抗体刺激后，处于 G2 期的细胞数量减少，死亡细胞数量增加。 Apo 细胞以时间依赖性方式增加，揭示了一种独特的特性，在 2 小时内达到 40%。我们还证实，用诺考达唑 (NZ) 处理 P815Fas 细胞可阻断抗 Fas 抗体诱导的 Apo。然而，我们还观察到博来霉素（BM）Apo 导致 G2 细胞增加，而 NZ 没有阻断这种增加。 2. P815Fas 的 Apo 刺激条件检查：BM (0.3U/ml)、抗 Fas (Jo0.1μg/ml)、C2-神经酰胺 (CM)（0.5%FCS 中 10μM）、甲萘醌（0.5%FCS 中 5μM） ) ), 热冲击 (45C结果表明，CCCP (50 μM)、十字霉素 (0.05 μM) 和金雀异黄素 (10 μg/ml) 可以诱导 Apo。 3.考察各种因素对P815Fas Apo的影响： 1）各种Tf细胞的抑制：APO抑制基因bcl-2和bclxL，p53的显性失活突变体minip53，最后应激途径A中c-Jun的磷酸化通过双Tfing SEK和P815Fas细胞中涉及的其他基因建立稳定克隆。 bc1-2和bclx L根本不阻断抗Fas抗体中的Apo，但minip53减少了G2细胞的减少并强烈阻断Apo。 2)肽(P)的抑制：抗Fas中的Apo在300μM的Z-VAD和300μM的DEVD下各3小时被强烈抑制，但在600μM的YVAD下3小时仅观察到轻微的抑制。 3）P-降解活性：我们证实DEVD在抗Fas刺激下被强烈降解，但YVDA没有被降解，而在BM或CM中没有观察到降解活性。 4）CPP32（木瓜蛋白酶）的降解活性：前者在抗Fas刺激和BM、CM刺激下表现出较强的分解活性，但后者没有观察到活性。 5) C-Jun的磷酸化：在抗Fas刺激下几乎没有观察到磷酸化，但在CM和BM、CM和热刺激下观察到强磷酸化。 6) p53、p21和bclx的积累：抗Fas抗体刺激后p53没有变化，p21减少，bclx增加；另一方面，在BM和CM中，抗Fas抗体刺激后p53和p21增加；我们观察到 bclx 增加，但 bclx 没有变化。 4.酵母系统的研究：为了研究bcl-2和ICE参与细胞周期和突变的可能性，用bcl-2或ICE处理酿酒酵母，并用0-12.5的γ射线照射刺激G1。 Krad.根据形态差异计算S、G2/M期细胞的百分比。另外，通过最小平板上的菌落数来比较γ射线照射引起的突变频率。然而，没有获得显着的结果。 5.其他：我们目前正在IPTG诱导条件下通过电穿孔将Rb和反义Rb注射到P815细胞中，并研究DNA损伤因素引起的细胞增殖和APO程度的差异。