アポトーシス発現機序の分子病理学的解析

细胞凋亡表达机制的分子病理学分析

• 批准号: 09670231
• 负责人: 松浦 恵子
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: 大分医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09670231/
• 关键词: アポトーシス; Fas; Bcl-2; ICE; C-jun; p53; 抗Fas; P815; セラマイド; トランスフェクション; 熱ショック; C-Jum; アポトーシス; Fas; Bcl-2; ICE; C-jun; p53; 抗Fas; P815; セラマイド; トランスフェクション; 熱ショック; C-Jum

1. FasTfマウス肥満細胞株P815(P815Fas)に及ぼす細胞周期及び薬剤の作用機序検討:Fas遺伝子をP815細胞にTfしFasを強く発現するP815Fas細胞株を樹立した。P815Fas細胞は抗Fas抗体の刺激によりG2期の細胞が減少し、死細胞が増加する。Apo細胞はtime-dependentに増加し、2時間で40%に達する特有の性質を明らかにした。nocodazol(NZ)でP815Fas細胞を処理すると抗Fas抗体によるApoが阻止されることも確認した。しかし、bleomycin(BM)のApoではG2細胞の増加が起こり、NZにより阻止されないことも観察した。2. P815Fasに及ぼすApo刺激条件の検討:BM(0.3U/ml)、抗Fas(Jo0.1μg/ml)、C2-ceramide(CM)(10μM in 0.5%FCS)、menadione(5μM in 0.5%FCS)、熱ショック(45C 30min)、CCCP(50μM)、stauromycin(0.05μM)、genistein(10μg/ml)でApo誘導可能であることを明らかにした。3. P815FasのApoに及ぼす諸因子の効果の検討:1)諸Tf細胞による抑制:APO抑制遺伝子bcl-2およびbclxL、p53のdominant negative mutant minip53,ストレス経路で最終的にc-Junの燐酸化に関与するSEKなどをP815Fas細胞にダブルTfし、stable cloneを樹立した。bc1-2およびbclx Lでは抗Fas抗体におけるApoが全く阻止されないが、minip53ではG2細胞の減少は少なくなり、Apoは強く阻止される成績を得た。2)ペプチド(P)による抑制:Z-VADで300μMおよびDEVDで300μM各3時間で抗FasにおけるApoが強く阻止されるが、YVADで600μM、3時間ではごく軽度の阻止に留まることを観察した。3)P分解活性:抗Fas刺激ではDEVDの分解が強く起こるが、YVDAの分解は見られないこと、いっぽう、BMやCMでは分解活性が見られないことを確認した。4)CPP32(apopain)の分解活性:抗Fas刺激とBMおよびCM刺激では前者が強い分解活性を示すが、後者には全く活性が見られない成績を得た。5)C-Junの燐酸化:抗Fas刺激では燐酸化は殆ど見られないが、CMではとBMおよびCMや熱刺激では強い燐酸化が見られることを観察した。6)p53、p21およびbclxの集積:抗Fas抗体刺激ではp53の変化は見られないこと、p21は減少し、bclxは増加すること、いっぽう、BMおよびCMでは抗Fas抗体刺激ではp53およびp21の増加が見られ、bclxには変化が見られないことを観察した。4. イースト系における検討:bcl-2やICEが細胞周期やmutationに関与する可能性を検討するためにS.cervisiaeにbcl-2あるいはICEをTfし、0-12.5Kradのγ線照射によりG1,S,G2/M期の細胞数の割合を形態の違いで計数した。また、γ線照射により生じるmutationの頻度をminimal plate上のコロニーの数で比較した。しかし、有意の成果はえられなかった。5. その他:P815細胞にIPTG-inducibleな条件下にRb,アンチセンスRbを電気穿孔法でTfし、細胞増殖の違いやDNA障害因子によるAPOの程度を検討中である。

1。对FASTF小鼠肥大细胞系P815（p815FAS）的细胞周期和作用机理的检查：将FAS基因TFAS TFES TFES置于P815细胞中，以建立强烈表达FAS的P815FAS细胞系。 p815FAS细胞中抗FAS抗体的刺激可减少G2相细胞并增加死细胞。 Apo细胞增加到时间依赖性，揭示了在2小时内达到40％的独特性质。还可以证实，用抗FAS抗体对p815FAS细胞（NZ）的治疗封闭了APO。然而，我们还观察到，博来霉素（BM）的APO中的G2细胞增加，而不会被NZ阻塞。 2. Examination of Apo stimulation conditions on P815Fas: We have revealed that Apo inducible with BM (0.3U/ml), anti-Fas (Jo0.1μg/ml), C2-ceramide (CM) (10μM in 0.5%FCS), menadine (5μM in 0.5%FCS), heat shock (45C 30min), CCCP (50μM),星霉素（0.05μm）和染料木黄酮（10μg/ml）。 3。检查各种因素对P815FAS APO的影响：1）TF细胞的抑制：Apo抑制基因Bcl-2和BClxl，p53的主要负突变型Minip53和SEK，最终参与了压力途径中C-Jun的磷酸化，在P815ffas and p815ffs and Clones and clone and Clones and clone and cclones and Storn and Storn and clone and Storpoble Clones and Stornect and clone and Storpose。 BC1-2和BCLX L不会阻断抗FAS抗体中的APO，但是MiniP53降低了G2细胞，从而导致APO的抑制更强。 2）通过肽（P）抑制：我们观察到300μm用Z-VAD和300μm的DEVD分别在3小时时，但使用YVAD为600μm，在3小时时抑制非常温和。 3）p降解活性：我们证实，当发生抗FAS刺激时，DEVD降解强烈发生，但是未观察到YVDA降解，而BM和CM则没有显示降解活性。 4）CPP32（ppopain）的降解活性：前者在抗FAS刺激以及BM和CM刺激中表现出强烈的降解活性，但后者根本没有活性。 5）C-JUN的磷酸化：我们观察到几乎没有在抗FAS刺激下观察到磷酸化，但是使用CM，BM，CM和热刺激观察到强磷酸化。 6）p53，p21和BCLX的积累：我们观察到，抗FAS抗体刺激没有看到p53的变化，p21降低并增加了BCLX，而BM和CM则显示抗FAS抗体刺激时p53和p21的增加，并且BCLX没有变化。 4。在酵母系统中进行的研究：为了研究Bcl-2和ICE可能参与细胞周期和突变的可能性，将Bcl-2或ICE TF置于宫颈链球菌中，并且根据0-12.5 Krad的辐射来计数G1，S和G2/M阶段中细胞的比例。此外，将由γ辐射引起的突变频率与最小板上的菌落数量进行了比较。但是，没有取得重大结果。 5。其他：在p815细胞中IPTG诱导的条件下，RB和反义RB是电穿孔的，并且正在研究细胞增殖的差异和由于DNA损伤因子引起的APO程度。