Analysis of miRNA polygenic network on hybrid sterility locus by novel forward genetics

通过新型正向遗传学分析杂交不育位点上的 miRNA 多基因网络

基本信息

批准号：
22KJ0365
负责人：
森本健斗
金额：
$ 1.98万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、精子形成に必須のmiRNA(以後、C1-XmiRs)の特定とその制御メカニズムの解明を目指し、特定の染色体領域だけに二つ以上のIndel変異やStructural Variantsを同時的かつランダムに導入する新規手法を開発している。C1-XmiRsが存在するゲノム領域にランダムに変異を誘導するため、これまでに各C1-XmiRゲノム領域を標的とするsgRNAを発現する合計17種のドナーベクターを、ランダムな組み合わせで染色体に導入したES細胞を作製した。続けて、このES細胞にCas9ベクターをトランスフェクションし、C1-XmiRsゲノム領域に変異を誘導した単一細胞由来のESクローンをこれまでに87クローン得た。ドナーベクターライブラリーの導入効率および導入されたsgRNAの組合せを確認するために、これら87のESクローンにおいて多検体次世代シークエンス解析を行い、1～16種類(平均4.7種類)のsgRNAベクターが導入されていることが明らかになった。続いて、導入されたsgRNAとCas9によってIndel変異やStructural Variantsを導入できたか確認したところ、25～93％の標的C1-XmiRゲノム領域でIndel変異やStructural Variantsが導入されていることが確認できた。また、これらの変異は導入されたsgRNAの組み合わせから期待される変異と一致していた。以上の結果は、本手法が特定の染色体領域に多種多様な変異を同時的かつランダムに導入したことを明確に示す。精子形成に必須のC1-XmiRsの特定とその制御メカニズムの解明するため、これらのC1-XmiRsランダム変異をF0世代で迅速に解析できるキメラマウス作出法を確立した。現在、C1-XmiRsランダム変異ESクローンからキメラマウスを発生させ、順次表現型比較解析を実施している。

这项研究旨在鉴定精子发生必不可少的miRNA（以下称为C1-XMIRS），并阐明控制它们的机制，并正在开发一种新的方法，该方法同时且随机地将两个或多个或多个indelel突变和结构变体引入特定的染色体区域。为了诱导存在C1-XMIRS的基因组区域中的随机突变，生成ES细胞，其中总共将靶向每个C1-XMIR基因组区域的SGRNA的17个供体向量引入了随机组合中。随后，用Cas9载体将来自单个细胞的87个ES克隆转染到ES细胞中，到目前为止，已经从诱导C1-XMIRS基因组区域突变的单个细胞中获得了87个克隆。为了确认供体库文库的效率和引入的SGRNA的组合，对这87个ES克隆进行了多个样品下一代测序分析，表明已经引入了1至16种类型的SGRNA矢量（平均4.7种类型）。接下来，我们确认是否可以使用引入的SGRNA和CAS9引入indel突变和结构变异，并确认在目标C1-X-XMIR基因组区域的25-93％中已经引入了indel突变和结构变体。另外，这些突变与合并引入的SGRNA预期的突变一致。以上结果清楚地表明，该方法同时又随机地将各种突变引入了特定的染色体区域。为了鉴定精子发生所必需的C1-XMIRS并阐明了其调节的机制，我们建立了一种生产嵌合小鼠的方法，该方法可以快速分析F0生成中这些随机的C1-XMIRS突变。当前，嵌合小鼠是由C1-XMIRS随机突变ES克隆产生的，并且正在进行表型比较分析。