Analysis of miRNA polygenic network on hybrid sterility locus by novel forward genetics

通过新型正向遗传学分析杂交不育位点上的 miRNA 多基因网络

基本信息

批准号：
22KJ0365
负责人：
森本健斗
金额：
$ 1.98万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、精子形成に必須のmiRNA(以後、C1-XmiRs)の特定とその制御メカニズムの解明を目指し、特定の染色体領域だけに二つ以上のIndel変異やStructural Variantsを同時的かつランダムに導入する新規手法を開発している。C1-XmiRsが存在するゲノム領域にランダムに変異を誘導するため、これまでに各C1-XmiRゲノム領域を標的とするsgRNAを発現する合計17種のドナーベクターを、ランダムな組み合わせで染色体に導入したES細胞を作製した。続けて、このES細胞にCas9ベクターをトランスフェクションし、C1-XmiRsゲノム領域に変異を誘導した単一細胞由来のESクローンをこれまでに87クローン得た。ドナーベクターライブラリーの導入効率および導入されたsgRNAの組合せを確認するために、これら87のESクローンにおいて多検体次世代シークエンス解析を行い、1～16種類(平均4.7種類)のsgRNAベクターが導入されていることが明らかになった。続いて、導入されたsgRNAとCas9によってIndel変異やStructural Variantsを導入できたか確認したところ、25～93％の標的C1-XmiRゲノム領域でIndel変異やStructural Variantsが導入されていることが確認できた。また、これらの変異は導入されたsgRNAの組み合わせから期待される変異と一致していた。以上の結果は、本手法が特定の染色体領域に多種多様な変異を同時的かつランダムに導入したことを明確に示す。精子形成に必須のC1-XmiRsの特定とその制御メカニズムの解明するため、これらのC1-XmiRsランダム変異をF0世代で迅速に解析できるキメラマウス作出法を確立した。現在、C1-XmiRsランダム変異ESクローンからキメラマウスを発生させ、順次表現型比較解析を実施している。

本研究旨在通过仅在特定染色体区域同时随机引入两个或多个Indel突变或结构变异来鉴定精子发生必需的miRNA（以下简称C1-XmiR）并阐明其控制机制。做这个。为了在 C1-XmiR 存在的基因组区域中随机诱导突变，总共产生了 17 种表达针对每个 C1-XmiR 基因组区域的 sgRNA 的供体载体，以随机组合的方式将其引入染色体中。随后，将Cas9载体转染到这些ES细胞中，目前已获得87个在C1-XmiRs基因组区域诱导突变的单细胞来源的ES克隆。为了确认供体载体库的导入效率以及导入的sgRNA的组合，我们对这87个ES克隆进行了多样本二代测序分析，发现1~16种（平均4.7种）sgRNA载体很明显，接下来，我们确认是否可以使用引入的sgRNA和Cas9引入Indel突变和结构变异，并证实在目标C1-XmiR基因组区域的25-93%中引入了Indel突变和结构变异。此外，这些突变与引入的 sgRNA 组合预期的突变一致。上述结果清楚地表明，该方法同时随机地将多种突变引入特定的染色体区域。为了鉴定精子发生所必需的 C1-XmiR 并阐明其调节机制，我们建立了一种嵌合小鼠生成方法，可以快速分析 F0 代中这些 C1-XmiR 的随机突变。我们目前正在从 C1-XmiRs 随机突变 ES 克隆生成嵌合小鼠，并进行连续比较表型分析。