難治性急性骨髄性白血病におけるEVI1遺伝子過剰発現メカニズムの解明

阐明EVI1基因过表达在难治性急性髓系白血病中的机制

基本信息

批准号：
22KJ0806
负责人：
林田裕樹
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0806/
关键词：
EVI1 白血病

项目摘要

EVI1は正常造血に必須で未分化な造血細胞分画に特異的に発現することが知られている。EVI1遺伝子が過剰発現した急性骨髄性白血病は極めて予後不良であり、特異的な治療法の開発が望まれている。本研究は、EVI1遺伝子の発現制御機構の解明を目指している。まず、EVI1高発現のヒト白血病細胞株において、EVI1遺伝子の終止コドンの位置にP2A-EGFP配列をノックインし、EVI1の発現量がGFPの蛍光強度と相関する細胞株を作成した。この細胞株に全ゲノムCRISPR/Cas9ノックアウトライブラリを導入し、フローサイトメーターを用いてGFPの蛍光が弱い細胞集団(GFPLow)と強い細胞集団(GHPHigh)に分別し、次世代シーケンサーで解析した。もしEVI1発現を増加させる因子がノックアウトされればGFPの蛍光が低下すると予想されるので、GFPLowで多く検出されたsgRNAの標的遺伝子を、統計学的にランキングして抽出した。上位の遺伝子について個別にノックアウト実験を行ったところ、複数のEVI1高発現細胞株において共通してEVI1の発現を増加させる因子を複数同定した。このうち、最も強くEVI1の発現に影響を与えた因子は、急性骨髄性白血病において細胞増殖やアポトーシス抑制作用を有する転写因子として報告されていたが、EVI1との関係については論じられたことがない因子であった。ChIP-seqでは、同因子はEVI1のプロモーター領域に結合することが示唆されている。今後、この因子がEVI1の発現にどのように関わっているのか、さらに詳細な検討を行っていく予定である。

EVI1 对于正常造血至关重要，并且已知在未分化的造血细胞组分中特异性表达。 EVI1基因过度表达的急性髓系白血病预后极差，需要开发特异性治疗方法。本研究旨在阐明EVI1基因的表达控制机制。首先，在高表达EVI1的人类白血病细胞系中，我们在EVI1基因的终止密码子处敲入P2A-EGFP序列，以创建EVI1表达水平与GFP荧光强度相关的细胞系。将全基因组CRISPR/Cas9敲除文库导入该细胞系中，使用流式细胞仪将细胞分为弱GFP荧光细胞群（GFPLow）和强GFP荧光细胞群（GHPHigh），并进行分析使用下一代测序仪。如果敲除增加EVI1表达的因子，GFP荧光预计会降低，因此我们对GFPLow经常检测到的sgRNA的目标基因进行统计排名并提取。当我们分别对顶级基因进行敲除实验时，我们发现了多种通常会增加多种 EVI1 高表达细胞系中 EVI1 表达的因素。在这些因子中，据报道对EVI1表达影响最大的因子是抑制急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的转录因子，但其与EVI1的关系从未被讨论过。 ChIP-seq 表明该因子与 EVI1 的启动子区域结合。未来，我们计划对该因子如何参与EVI1表达进行更详细的研究。