ウシの白血球粘着異常症の遺伝子治療に関する基礎的研究

牛白细胞粘附障碍基因治疗的基础研究

基本信息

批准号：
08760289
负责人：
田島誉士
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760289/
关键词：
ウシ白血球粘着異常症 BLAD 遺伝子発現 CD18

项目摘要

ウシの常染色体劣性遺伝性疾患である牛白血球粘着異常症状(BLAD)をモデルとした、遺伝子療法をより効率的かつ安全に実施するための基礎的な検討を行うことを目的として以下の研究を実施した。まず、正常なウシの末梢血白血球(PBL)から、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用して特異的なプライマーを用いてCD18遺伝子を増幅させた。この増幅遺伝子をプラスミドベクターにサブクローニングし、ウシCD18遺伝子組込みプラスミドベクター(pMosCD18bo)を得た。またPCR増幅遺伝子を、サイトメガロウイルスのプロモーターを有するプラスミドに組込み、ウシCD18遺伝子組込みプラスミド発現ベクター(pTargetCD18bo)を得ることができた。これら2種類のプラスミドのインサート部分の全塩基配列を解読したところ、サイレント変異が確められたものの理論上は正常なCD18分子を合成できることが確認された。そこで、pMosCD18boのインサート遺伝子をLTRあるいはSV40遺伝子をプロモーターとして有する二種類の発現ベクターに再組換えし、三種類の異なるプロモーターを有する発現ベクターの作成を試みた。しかしこれら二種類のベクターは、現在クローニング中である。次に導入効率を検討するために、エレクトロポレーション法およびリポフェクション法によりBLAD発症牛のPBLにin vitroでpTargetCD18boの導入を試みた。その結果いずれの方法を用いても導入効率はほぼ同程度であった。しかし、エレクトロポレーション法により導入されたPBLの培養可能期間は著しく短縮し、したがってCD18分子の発現効率も低かった。リポフェクション法により導入されたPBLにおいて、CD18分子の発現は確認されたが、既報のレトロウイルスベクターを用いた場合に比べるとその発現効率は低かった。現在クローニング中のベクターを用いた同様の検討を行うことにより、より効率的な発現法の確立が可能になると考えられた。

我们进行了以下研究，目的是使用牛白细胞粘附障碍（BLAD）（一种牛常染色体隐性遗传病）作为模型，进行更有效、更安全地实施基因治疗的基础研究。首先，使用聚合酶链式反应（PCR）方法，使用特异性引物从正常牛外周血白细胞（PBL）中扩增CD18基因。将该扩增基因亚克隆到质粒载体中，得到掺入牛CD18基因的质粒载体(pMosCD18bo)。另外，将PCR扩增的基因整合到具有巨细胞病毒启动子的质粒中，得到整合了牛CD18基因的质粒表达载体(pTargetCD18bo)。当解码这两类质粒的插入部分的完整核苷酸序列时，证实了沉默突变，但理论上证实可以合成正常的CD18分子。因此，我们尝试通过将pMosCD18bo的插入基因重组为分别以LTR或SV40基因作为启动子的两种类型的表达载体来创建具有三种不同启动子的表达载体。然而，这两个载体目前正在被克隆。接下来，为了检查导入效率，我们尝试使用电穿孔和脂转染方法将pTargetCD18bo体外导入BLAD受影响的奶牛的PBL中。结果，无论使用哪种方法，引入效率大致相同。但电穿孔法导入的PBL的培养时间明显缩短，因此CD18分子的表达效率也较低。通过脂转染导入的PBL中证实了CD18分子的表达，但表达效率低于先前报道的使用逆转录病毒载体时的表达效率。人们认为，通过使用目前正在克隆的载体进行类似的研究，可以建立更有效的表达方法。