ウシの白血球粘着異常症の遺伝子治療に関する基礎的研究

牛白细胞粘附障碍基因治疗的基础研究

• 批准号: 08760289
• 负责人: 田島 誉士
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760289/
• 关键词: ウシ白血球粘着異常症; BLAD; 遺伝子発現; CD18; ウシ白血球粘着異常症; BLAD; 遺伝子発現; CD18

ウシの常染色体劣性遺伝性疾患である牛白血球粘着異常症状(BLAD)をモデルとした、遺伝子療法をより効率的かつ安全に実施するための基礎的な検討を行うことを目的として以下の研究を実施した。まず、正常なウシの末梢血白血球(PBL)から、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用して特異的なプライマーを用いてCD18遺伝子を増幅させた。この増幅遺伝子をプラスミドベクターにサブクローニングし、ウシCD18遺伝子組込みプラスミドベクター(pMosCD18bo)を得た。またPCR増幅遺伝子を、サイトメガロウイルスのプロモーターを有するプラスミドに組込み、ウシCD18遺伝子組込みプラスミド発現ベクター(pTargetCD18bo)を得ることができた。これら2種類のプラスミドのインサート部分の全塩基配列を解読したところ、サイレント変異が確められたものの理論上は正常なCD18分子を合成できることが確認された。そこで、pMosCD18boのインサート遺伝子をLTRあるいはSV40遺伝子をプロモーターとして有する二種類の発現ベクターに再組換えし、三種類の異なるプロモーターを有する発現ベクターの作成を試みた。しかしこれら二種類のベクターは、現在クローニング中である。次に導入効率を検討するために、エレクトロポレーション法およびリポフェクション法によりBLAD発症牛のPBLにin vitroでpTargetCD18boの導入を試みた。その結果いずれの方法を用いても導入効率はほぼ同程度であった。しかし、エレクトロポレーション法により導入されたPBLの培養可能期間は著しく短縮し、したがってCD18分子の発現効率も低かった。リポフェクション法により導入されたPBLにおいて、CD18分子の発現は確認されたが、既報のレトロウイルスベクターを用いた場合に比べるとその発現効率は低かった。現在クローニング中のベクターを用いた同様の検討を行うことにより、より効率的な発現法の確立が可能になると考えられた。

进行了以下研究，目的是进行基本研究以更有效，更安全地对基因疗法进行，以牛白细胞粘附异常（BLAD）的常染色体隐性遗传疾病进行建模，该疾病是一种牛常染色体遗传遗传疾病。首先，使用特定引物，使用聚合酶链反应（PCR）方法从正常牛外周血白细胞（PBL）中扩增CD18基因。将该扩增的基因亚克隆到质粒载体中，以获得牛CD18基因整合质粒载体（PMOSCD18BO）。此外，将PCR扩增基因整合到带有巨细胞病毒启动子的质粒中，并获得了牛CD18基因综合质粒表达载体（PTARGETCD18BO）。当对这两个质粒的插入部分的整个碱基序列被解密时，确认尽管已经确认了静音突变，但从理论上讲，可以合成正常的CD18分子。因此，将PMOSCD18BO的插入基因重组为具有LTR或SV40基因作为启动子的两个表达矢量，并尝试尝试具有三个不同启动子的表达矢量。但是，这两个向量目前正在克隆中。接下来，为了调查引言的效率，我们试图在使用电穿孔和LiPofection方法的载体中引入PTARGETCD18BO。结果，无论方法如何，引入效率大致相同。但是，电穿孔引入的PBL培养周期显着缩短，因此CD18分子的表达效率也很低。通过LiPofection方法引入的PBL证实了CD18分子的表达，但表达效率低于使用先前报道的逆转录病毒载体时。据认为，通过使用当前在克隆下的向量进行类似的研究，将有可能采用更有效的表达方法。