T細胞受容体を介した転写因子NF-kB活性化においてカルシウム依存性の分子機構

T细胞受体介导转录因子NF-kB激活钙依赖的分子机制

• 批准号: 08839010
• 负责人: 菅野 智彦
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08839010/
• 关键词: T細胞受容体シグナル; シグナル伝達; NF-kB; raf-1キナーゼ; カルシニューリンフォスファターゼ; Ca2^+チャネルブロッカー; プロテインキナーゼC抑制剤; カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ

T細胞受容体を介するシグナルは転写因子NF-kBを活性化し、このNF-kBにより様々の標的遺伝子の転写が誘導されて活性化T細胞に特有の表現型が現れる。このT細胞活性化の過程はT細胞をPMAとCa2^+イオノフォアで処理する事により再現でき、T細胞を活性化する方法として広く用いられている。我々はT細胞受容体刺激の下流を構成する因子を検索しNF-kB活性化シグナルを媒介するキナーゼとフォスファターゼを同定した。T細胞受容体シグナルを誘起する方法として、PMAとCa2^+イオノフォアの併用に加えPHA刺激及び抗CD3抗体処理を用い比較検討した。T細胞受容体シグナルによるNF-kBの活性化は、ゲルシフト法及びkB結合部位依存性のレポーターアッセイで解析した。PHA刺激によるNF-kBの活性化はプロテインキナーゼC抑制剤スタウロスポリンで抑制されなかった。一方PMA刺激によるNF-kB活性化はスタウロスポリンで完全に抑制された。これはT細胞受容体刺激によるNF-kBの活性化にはプロテインキナーゼCが必要不可欠でない事を示唆する。PHA刺激で誘導されるNF-kBに由来するレポーター活性の上昇は、ドミナントネガテイブ型のRaf-1キナーゼを強発現させると効果的に抑制された。これはRaf-1キナーゼがシグナル伝達系の構成要素である事を示唆する。T細胞受容体刺激に伴なうCa2^+流入をCa2^+チャネルブロッカーSK&F96365で抑制すると、NF-kBの活性化も抑制された。その際T細胞に恒常的活性型のカルシニューリンを強発現させておくとCa2^+の流入がなくてもNF-kBの活性化を部分的に復元することができた。同様の実験でカルモジュリン依存性プロテインキナーゼを強発現させた場合は、カルシウム流入抑制状態でNF-kBの活性化を復元できなかった。さらにT細胞に恒常的活性型のRafキナーゼとカルシニューリンを同時に発現させると、相乗的にkB結合部位依存性のレポーター活性を上昇させた。以上よりT細胞受容体刺激の下流にあり転写因子NF-kBを活性化させるシグナル伝達系を構成する要素として、Raf-1キナーゼ及びカルシニューリンの存在が強く示唆された。それに比べ従来考えられていたプロテインキナーゼC、あるいはカルモジュリン依存性プロテインキナーゼの積極的関与は認められなかった。

通过T细胞受体的信号激活了转录因子NF-KB，并且该NF-KB诱导各种靶向基因的转录，并且出现了激活T细胞独有的表达类型。该T细胞激活的过程可以通过用PMA和Ca2^+Ionofore处理T细胞来再现，并被广泛用作激活T细胞的方法。我们搜索了构成T细胞受体刺激下游的因素，并鉴定出传输NF-KB激活信号的激酶和fosfatase。作为诱导T细胞受体信号的方法，除了PMA和Ca2^+ionofore的综合使用外，还使用PHA刺激和抗-CD3抗体处理进行了比较和检查。通过GELSIFT定律和KB连接零件依赖性记者测定法分析了T细胞受体信号对NF-KB的激活。因PHA刺激而引起的NF-KB的激活并不能被激酶C抑制剂星形孢菌素抑制。另一方面，由于星形孢菌素完全抑制了由于PMA刺激引起的NF-KB激活。这表明生理激酶C是通过T细胞受体刺激激活NF-KB必不可少的。当强烈出现主要的负面TAB型RAF-1激酶时，从受PHA刺激引导的NF-KB得出的报告升高得到了有效抑制。这表明RAF-1激酶是信号传输系统的同义词元素。通过抑制Ca2^+流入并用Ca2^+通道阻滞剂SK和F96365伴随T细胞受体刺激，也抑制了NF-KB的激活。当时，如果在T细胞中恒定的活性结石蛋白，则可以部分恢复NF-KB的激活，而不会流入Ca2^+。在同一实验中，当强烈出现钙调蛋白依赖性蛋白酶蛋白依赖性蛋白酶时，在引入钙流入的状态下，NF-KB的振兴无法恢复。此外，当同时表达恒定活性RAF激酶和计算蛋白的T细胞时，KB结合位点依赖性的报告基因活性会协同增加。从上面，强烈建议将RAF-1激酶和骨素的存在作为构成T细胞受体刺激下游的信号传输系统的元素，并激活转录因子NF-KB。相比之下，所提出的伸肌激酶C或钙蛋白酶依赖性促蛋白酶没有侵略性参与。

项目成果

Kanno T and Seibenlist U.: "Activation of nuclear factor-kappaB via T cell receptor requires a raf kinase and Ca^<2+> influx.Functional synergy between raf and calcineurin." Journal of Immunology. 157. 5277-5283 (1996)

Kanno T 和 Seibenlist U.：“通过 T 细胞受体激活核因子-kappaB 需要 raf 激酶和 Ca^2 流入。raf 和钙调磷酸酶之间的功能协同作用。”