T細胞受容体を介した転写因子NF-kB活性化においてカルシウム依存性の分子機構

T细胞受体介导转录因子NF-kB激活钙依赖的分子机制

• 批准号: 08839010
• 负责人: 菅野 智彦
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08839010/
• 关键词: T細胞受容体シグナル; シグナル伝達; NF-kB; raf-1キナーゼ; カルシニューリンフォスファターゼ; Ca2^+チャネルブロッカー; プロテインキナーゼC抑制剤; カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ

T細胞受容体を介するシグナルは転写因子NF-kBを活性化し、このNF-kBにより様々の標的遺伝子の転写が誘導されて活性化T細胞に特有の表現型が現れる。このT細胞活性化の過程はT細胞をPMAとCa2^+イオノフォアで処理する事により再現でき、T細胞を活性化する方法として広く用いられている。我々はT細胞受容体刺激の下流を構成する因子を検索しNF-kB活性化シグナルを媒介するキナーゼとフォスファターゼを同定した。T細胞受容体シグナルを誘起する方法として、PMAとCa2^+イオノフォアの併用に加えPHA刺激及び抗CD3抗体処理を用い比較検討した。T細胞受容体シグナルによるNF-kBの活性化は、ゲルシフト法及びkB結合部位依存性のレポーターアッセイで解析した。PHA刺激によるNF-kBの活性化はプロテインキナーゼC抑制剤スタウロスポリンで抑制されなかった。一方PMA刺激によるNF-kB活性化はスタウロスポリンで完全に抑制された。これはT細胞受容体刺激によるNF-kBの活性化にはプロテインキナーゼCが必要不可欠でない事を示唆する。PHA刺激で誘導されるNF-kBに由来するレポーター活性の上昇は、ドミナントネガテイブ型のRaf-1キナーゼを強発現させると効果的に抑制された。これはRaf-1キナーゼがシグナル伝達系の構成要素である事を示唆する。T細胞受容体刺激に伴なうCa2^+流入をCa2^+チャネルブロッカーSK&F96365で抑制すると、NF-kBの活性化も抑制された。その際T細胞に恒常的活性型のカルシニューリンを強発現させておくとCa2^+の流入がなくてもNF-kBの活性化を部分的に復元することができた。同様の実験でカルモジュリン依存性プロテインキナーゼを強発現させた場合は、カルシウム流入抑制状態でNF-kBの活性化を復元できなかった。さらにT細胞に恒常的活性型のRafキナーゼとカルシニューリンを同時に発現させると、相乗的にkB結合部位依存性のレポーター活性を上昇させた。以上よりT細胞受容体刺激の下流にあり転写因子NF-kBを活性化させるシグナル伝達系を構成する要素として、Raf-1キナーゼ及びカルシニューリンの存在が強く示唆された。それに比べ従来考えられていたプロテインキナーゼC、あるいはカルモジュリン依存性プロテインキナーゼの積極的関与は認められなかった。

T细胞受体介导的信号激活了转录因子NF-KB，该信号诱导各种靶基因的转录，从而导致活化T细胞独有的表型。可以通过用PMA和CA2^+离子载体处理T细胞来重新创建T细胞激活的过程，并广泛用作激活T细胞的方法。我们搜索了构成T细胞受体刺激下游的因素，并鉴定出介导NF-KB激活信号的激酶和磷酸酶。作为诱导T细胞受体信号的一种方法，比较了PMA和CA2^+离子载体与PHA刺激结合使用，并比较了抗CD3抗体处理。通过T细胞受体信号激活NF-KB，通过凝胶转移和Kb结合位点依赖性记者测定法分析了NF-KB。通过PHA刺激激活NF-KB并不能被蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素抑制。同时，星形孢菌素完全抑制了通过PMA刺激激活NF-KB。这表明蛋白激酶C对于通过T细胞受体刺激激活NF-KB并不是必需的。 PHA刺激引起的NF-KB衍生的报告基因活性的增加，通过强烈的负RAF-1激酶的强烈表达有效地抑制了。这表明RAF-1激酶是信号系统的组成部分。用Ca2^+通道阻滞剂SK＆F96365抑制CA2^+流入，并伴随着T细胞受体刺激，也抑制了NF-KB激活。在这种情况下，在T细胞中实现了组成性活性钙调蛋白的强烈表达，即使没有CA2^+流入，NF-KB的激活也可以部分恢复。在类似的实验中，当强烈表达钙调蛋白依赖性蛋白激酶时，在抑制钙涌入的状态下，NF-KB激活无法恢复。此外，当T细胞同时表达组成型活性RAF激酶和钙调神经酶时，协同增加了Kb结合位点依赖性的报道器活性。上述结果强烈表明RAF-1激酶和钙调神经酶的存在是构成T细胞受体刺激下游信号转导系统并激活转录因子NF-KB的元素。相比之下，没有观察到以前认为的蛋白激酶C或钙调蛋白依赖性蛋白激酶的主动参与。

项目成果

Kanno T and Seibenlist U.: "Activation of nuclear factor-kappaB via T cell receptor requires a raf kinase and Ca^<2+> influx.Functional synergy between raf and calcineurin." Journal of Immunology. 157. 5277-5283 (1996)

Kanno T 和 Seibenlist U.：“通过 T 细胞受体激活核因子-kappaB 需要 raf 激酶和 Ca^2 流入。raf 和钙调磷酸酶之间的功能协同作用。”