蛋白質相互作用の速度論的調節機構に関する構造細胞生物学的研究

蛋白质相互作用动力学调控机制的结构细胞生物学研究

• 批准号: 12J30003
• 负责人: 小山 昌子
• 金额: $ 2.53万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J30003/
• 关键词: CRM1; Xpo1p; Yrb2p; Ran; 核細胞質間輸送; X線結晶解析; 反応速度論; 核-細胞質間輸送; Yrb2; キネティクス解析; 核膜孔; Nup

Xpo1p (exportin 1, CRM1)は代表的なexportinであり、ロイシンリッチ核外輸送シグナル（NES）をもつ多様なcargoを核から細胞質へ一方向に輸送する。細胞内において輸送が効率的に行われるためには、核内でXpo1pがRanGTP依存的にcargoを積込む反応（核外輸送複合体の形成反応）が速やかに起こる必要がある。我々はこれまでに、核内に局在するRan結合蛋白質Yrb2pがXpo1p核外輸送複合体形成の反応速度を劇的に上昇させることを見出し、反応中間体に相当するXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体の結晶構造を2.22 A分解能で解いた。さらにXpo1p-cargo-RanGTP複合体（核外輸送複合体）の結晶構造も2.15 A分解能で解き、これらの構造比較からYrb2pによるXpo1p核外輸送複合体の形成促進機構のモデルを推測した。これまで、構造情報に基づいて作成した変異体を用いてin vitroおよびin vivoの検証実験を行いモデルを支持する結果を得てきたが、本年度はさらなる検証実験を行い、核内におけるYrb2pの作用機構を確立した。第一に、Yrb2pのRanBDがXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体から解離する反応のキネティクスを解析するための実験系を確立し、cargoがXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体に結合することによりYrb2pのRanBDの解離を促進することを明らかにした。また、出芽酵母の生細胞を用いてNuclear transport assayを行い、Yrb2pのFGリピートの機能的重要性を検証した。さらに、出芽酵母の生細胞内でYFP-Xpo1pとCFP-Yrb2p間で起こるFRETをacceptor photobleachingにより検出し、Xpo1pとYrb2pの核内における結合が、Xpo1pによるcargo核外輸送において重要であることを示した。以上の結果をまとめて、Cell Reports誌に論文を発表した。

Xpo1p（出口蛋白1，CRM1）是一种典型的出口蛋白，它通过富含亮氨酸的核输出信号（NES）将各种货物从细胞核单向运输到细胞质。为了在细胞内有效地进行运输，Xpo1p 以 RanGTP 依赖性方式装载货物的反应（核输出复合物的形成反应）必须在细胞核中快速发生。我们之前发现，位于细胞核中的 Ran 结合蛋白 Yrb2p 显着提高了 Xpo1p 核输出复合物形成的反应速率，并以 2.22 A 分辨率解析了 Xpo1p 的晶体结构。此外，以2.15 A分辨率解析了Xpo1p-cargo-RanGTP复合物（核输出复合物）的晶体结构，通过比较这些结构，建立了促进Xpo1p核输出复合物形成的机制的模型推导出Yrb2p。迄今为止，我们已经利用基于结构信息创建的突变体进行了体外和体内验证实验，并获得了支持我们模型的结果。今年，我们将进行进一步的验证实验，并证明Yrb2p在细胞核中的作用机制。成立。首先，我们建立了一个实验系统来分析Yrb2p的RanBD从Xpo1p-Yrb2p-RanGTP复合物解离的反应动力学，结果表明它促进解离。我们还使用酿酒酵母活细胞进行核转运测定，以验证 Yrb2p 中 FG 重复的功能重要性。此外，我们通过受体光漂白在酿酒酵母活细胞中检测到 YFP-Xpo1p 和 CFP-Yrb2p 之间的 FRET，并证明 Xpo1p 和 Yrb2p 在细胞核中的结合对于 Xpo1p Ta 的货物核输出很重要。我们总结了上述结果，并在 Cell Reports 上发表了论文。

项目成果

核内のRan結合蛋白質Yrb2がCRM1による核外輸送を促進する機構

核Ran结合蛋白Yrb2通过CRM1促进核输出的机制

• 发表时间: 2013
• 作者: 小山昌子

核内のRan結合蛋白質Yrb2がCRM1による核外輸送を触媒的に促進する機構の構造基盤

核Ran结合蛋白Yrb2通过CRM1催化促进核输出机制的结构基础

• 发表时间: 2012
• 作者: 小山昌子

CRM1核外輸送複合体の形成と解体の構造基盤の解明と創薬への応用

阐明CRM1核输出复合体形成和分解的结构基础及其在药物发现中的应用

• 发表时间: 2015
• 作者: 小山昌子;松浦能行
• 通讯作者: 松浦能行

出芽酵母の核局在型Ran結合蛋白質Yrb2pが核外輸送受容体CRM1への積み荷積載反応をスピードアップする機構の構造基盤

酿酒酵母核定位Ran结合蛋白Yrb2p加速核输出受体CRM1的货物装载反应机制的结构基础

• 发表时间: 2014
• 作者: 小山昌子;白井菜月;松浦能行
• 通讯作者: 松浦能行

出芽酵母のRan結合蛋白質Yrb2pがXpo1p (CRM1)による核外輸送を促進する機構の構造基盤

酿酒酵母 Ran 结合蛋白 Yrb2p 通过 Xpo1p (CRM1) 促进核输出机制的结构基础

• 发表时间: 2014
• 作者: 小山昌子;白井菜月;松浦能行
• 通讯作者: 松浦能行