精巣細胞の初代培養を利用した精子への遺伝子導入法の開発

开发利用睾丸细胞原代培养物将基因导入精子的方法

基本信息

批准号：
09878133
负责人：
中西義信
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878133/
关键词：
精子形成遺伝子導入細胞培養

项目摘要

この研究では、遺伝子改変を施した精子あるいは生殖可能な精子形成細胞を作りだし、それを利用して効率よく哺乳動物の形質転換を行う方法を開発することが目的である。今年度の研究では、精子分化途中の段階にある精子形成細胞へ遺伝子を導入し、導入された遺伝子の発現を解析した。まず、研究代表者らが以前に開発したラット精子形成細胞の初代培養系を利用して、精子分化のさまざまな段階にある精子形成細胞を分取した。これらの細胞群に、エレクトロポレーション法およびリポフェクション法によリ、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にグリーンフルオレッセントプロティン(GFP)を発現するプラスミドDNAを導入し、GFPの生産を蛍光顕微鏡を用いて検討した。しかし、すべての精子形成細胞群について、いずれのDNA導入法を用いても、はっきリしたGFPの発現は観察されなかった。そこで次に、DNAを導入した精子形成細胞をセルトリ細胞と共培養した後にGFPの発現を調べたが、この場合も結果はネガティブであった。これらの結果は、精子形成細胞へのDNAの導入効率が低いのか、あるいは導入されたDNAからの遺伝子発現が弱いかのどちらかによると思われる。前者については、ウイルスベクターの利用が有効だと思われるが、現段階では有効なベクターの候補が見当たらない。後者については、精子形成細胞内で効率よく遺伝子転写を導くプロモーターを見いだし、それを導入ベクターに取リ入れる工夫が必要である。

这项研究的目的是通过使用这些细胞来开发一种通过遗传改变的精子或生殖精子发生细胞来有效转化哺乳动物的方法。在今年的研究中，将基因转移到精子分化中间的精子发生细胞中，并分析了转染基因的表达。首先，我们使用了先前由研究人员开发的大鼠精子发生细胞的主要培养系统来对精子发生分化的各个阶段进行精子发生细胞。通过电穿孔和lipofection控制这些细胞基团在巨细胞病毒启动子的控制下将表达绿色荧光蛋白（GFP）引入质粒DNA中，并使用荧光显微镜检查了GFP的产生。但是，对于所有用于任何精子发生细胞群的DNA转移方法，对于所有精子发生细胞，均未观察到GFP的明显表达。接下来，在与Sertoli细胞共培养DNA转移的精子发生细胞后检查了GFP的表达，在这种情况下，结果也为阴性。这些结果似乎是由于DNA转导向精子发生细胞的效率较低，或者是来自转染的DNA的基因表达弱。对于前者而言，人们认为使用病毒载体是有效的，但是在此阶段，没有候选有效向量的候选者。对于后者，有必要找到一个启动子，该启动子有效地指导精子发生细胞中的基因转录并将其纳入引入载体。