金属ナノ粒子－タンパク質複合体の生体内一段階調製プロセスの開発

金属纳米颗粒-蛋白质复合物一步体内制备工艺的开发

基本信息

批准号：
12J05872
负责人：
二井手哲平
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)によるNADH補酵素再生系に対して、金結合性ペプチドを融合した機能性タンパク質を共存させることで、目的とする機能性タンパク質が金ナノ粒子表面に修飾された金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製を試みた。まず、3つの異なる機能(精製用タグとしてヘキサヒスチジンタグ(His-tag)およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、抗体結合ドメインとしてプロテインGおよびプロテインA、金結合ペプチドとしてA3ペプチド)を有する機能性タンパク質をデザインした。また、各ドメインが金ナノ粒子の形成や結合に与える影響を評価するために、A3ペプチドを欠損させたタンパク質および精製用タグを欠損させたタンパク質も調製し、評価に用いた。その結果、抗体結合ドメイン融合タンパク質存在下においてもGLD酵素反応による金ナノ粒子合成反応は進行し、生成した金ナノ粒子表面に当該融合タンパク質が結合していることを確認した。さらに、得られた抗体結合ドメイン修飾金ナノ粒子を用いたEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)の結果から、金ナノ粒子上に固定化された融合タンパク質は、金結合性ペプチドを介してその機能を保持した状態で金ナノ粒子上に固定化されていることが明らかとなった。さらに、大腸菌由来GLDに代え、より安定で結晶構造が入手可能なBacillus stearothermophlius由来GLD (BsGLD)を用いてタンパク質修飾金ナノ粒子の調製を試みた。BsGLDの高次構造情報を基に、機能性タンパク質と金結合ペプチドの双方を遺伝子工学的手法により融合させた新規キメラタンパク質を調製することで、単一タンパク質成分によるタンパク質修飾金ナノ粒子の一段階合成を試みた。その結果、金ナノ粒子合成と粒子表面への提示を一種類の融合タンパク質が担う金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製に成功した。また、本手法により調製された金ナノ粒子上に固定されたタンパク質の機能が十分に保持されていることをELISAにより確認した。

在这项研究中，通过使用甘油脱氢酶（GLD）将与金结合肽融合的功能蛋白共存到NADH辅酶再生系统中，在金纳米粒子的表面上修饰目标功能蛋白，我们尝试制备金纳米粒子-蛋白质。复杂的。首先，具有三种不同功能的功能蛋白（六组氨酸标签（His-tag）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为纯化标签，蛋白G和蛋白A作为抗体结合结构域，A3肽作为金结合肽）设计的。此外，为了评价各结构域对金纳米颗粒形成和结合的影响，还制备了缺少A3肽的蛋白质和缺少纯化标签的蛋白质并用于评价。其结果，确认即使在抗体结合结构域融合蛋白的存在下，基于GLD酶反应的金纳米粒子合成反应也进行，并且该融合蛋白与生成的金纳米粒子的表面结合。此外，使用抗体结合结构域修饰的金纳米颗粒进行酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果表明，固定在金纳米颗粒上的融合蛋白通过金结合肽发挥其功能。以保留状态固定在金纳米颗粒上。此外，我们尝试使用嗜热脂肪芽孢杆菌衍生的GLD（BsGLD）来制备蛋白质修饰的金纳米粒子，它更稳定且具有可用的晶体结构，而不是大肠杆菌衍生的GLD。基于BsGLD的高阶结构信息，我们利用基因工程技术制备了一种融合功能蛋白和金结合肽的新型嵌合蛋白，使得利用单一蛋白质成分制备蛋白质修饰的金纳米颗粒成为可能。我尝试了第一步。结果，我们成功制备了金纳米颗粒-蛋白质复合物，其中单一类型的融合蛋白负责金纳米颗粒的合成和颗粒表面的呈现。此外，通过ELISA证实，通过该方法制备的固定在金纳米颗粒上的蛋白质的功能被充分保留。