金微粒子をキャリアーとした外来遺伝子の細胞内導入の研究

金微粒为载体细胞内导入外源基因的研究

基本信息

批准号：
08878112
负责人：
中西守
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878112/
关键词：
遺伝子治療金微粒子法正電荷コレステロール法電気穿孔法プラスミド遺伝子アンチセンスDNA ルシフェラーゼ活性エンドサイトーシス遺伝子導入外来遺伝子プラスミドルシフェラーゼ金粒子アンチセンス共焦点レーザ顕微鏡 CAT遺伝子

项目摘要

遺伝子治療は遺伝病の根元的治療法になるだけでなく、癌やエイズの治療にも有効であると期待されている。しかし、遺伝子治療の臨床応用での成功例はあるものの、その基盤となる基礎研究は著しく立ち遅れており、多くの解決しなければならない問題をかかえている。その一つは安全性が高くて、効率のよい外来遺伝子の細胞内導入法の確立である。そこで、本研究では外来遺伝子の細胞内導入のための非ウイルス系のキャリアーの開発を試みた。具体的には、金微粒子法、正電荷コレステロール法、電気穿孔法等について種々の検討を加えた。導入遺伝子としては、プラスミド遺伝子(CATとLuc遺伝子)とアンチセンスDNAを用いた。遺伝子導入の効率は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの酵素活性の測定法、ルミノメータによるルシフェラーゼ活性の測定法、フローサイトメータによる蛍光標識アンチセンスDNAの細胞内取り込み量の測定法、共焦点レーザ顕微鏡による蛍光標識アンチセンスDNAの細胞質と核への分布の測定法を確立して行った。動物細胞の場合には、正電荷リポソームや金微粒子はエンドサイトーシスでもって細胞内に十分に取り込まれることを明らかにした。それゆえ、特に電気穿孔法のような過激な条件を用いることなく、外来遺伝子を動物細胞に導入できることが、判明した。それと同時に、リポソームや微粒子が細胞内にエンドサイトーシスされる際には、DNAと複合体を形成した粒子のサイズが大変重要であることが明らかになってきた。原子間力顕微鏡を用いた実験の結果、粒子のサイズは400nm程度よりも大きく、1.5μm程度よりも小さい中間のサイズが細胞内への導入に最も効率がよいことが明らかになった。これらの本実験で検討したベクターは安全性も高く、遺伝子治療の基盤技術として、今後の研究の進展に大きく寄与するものと考えられた。

基因疗法有望不仅成为遗传性疾病的根本治疗方法，而且有望有效治疗癌症和艾滋病。然而，虽然基因治疗已经有了临床应用的成功案例，但构成基因治疗基础的基础研究却明显滞后，存在许多问题需要解决。其中之一就是建立一种高度安全、高效的将外源基因引入细胞的方法。因此，在本研究中，我们试图开发一种将外源基因引入细胞的非病毒载体。具体而言，对金粒子法、带正电胆固醇法、电穿孔法等进行了各种研究。使用质粒基因(CAT和Luc基因)和反义DNA作为导入基因。基因导入的效率可以通过测定氯霉素乙酰转移酶的酶活性、使用光度计测定荧光素酶活性、使用流式细胞仪测定进入细胞内的荧光标记的反义DNA的量、以及使用共聚焦激光显微镜来确定。测量荧光标记反义DNA在细胞质和细胞核中的分布的方法。就动物细胞而言，带正电的脂质体和金微粒通过胞吞作用被充分摄取到细胞内。因此，发现无需特别使用电穿孔等极端条件即可将外源基因导入动物细胞。同时，人们已经清楚，当脂质体和微粒被内吞到细胞中时，与 DNA 形成复合物的颗粒的大小极其重要。使用原子力显微镜的实验表明，大于约 400 nm 的颗粒尺寸和小于约 1.5 μm 的中间尺寸对于引入细胞最有效。这些实验中检查的载体高度安全，预计将极大地促进作为基因治疗基础技术的未来研究进展。