肝発生環境を模倣したヒトｉＰＳ細胞からの肝分化誘導システムの開発とその応用

模拟肝脏发育环境的人iPS细胞诱导肝脏分化系统的研制及其应用

基本信息

批准号：
12J03334
负责人：
樋口麻衣子
金额：
$ 2.53万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J03334/
关键词：
ヒトiPS細胞肝細胞分化誘導法三次元培養

项目摘要

ヒト人工多能性肝細胞(iPS細胞)は、肝細胞等のあらゆる細胞に分化することから、再生医療への応用や、薬物のin vitro毒性スクリーニング系に応用することが期待されている。ヒトiPS細胞から高効率かつ高機能な成熟肝細胞を分化誘導可能な方法を確立するために、生体内肝臓環境をin vitroで模倣した分化培養系の構築、具体的には、肝発生時に隣接している細胞および肝組織構成細胞との共培養が可能な三次元分化培養系の確立を目指し、研究を遂行した。三次元培養法が種々存在する中で、共培養細胞とiPS細胞由来分化誘導細胞との隣接面積が高く、且つ細胞と足場素材との相互作用を極力無視できるといった点から集積培養法に着目した。この方法は、細胞1個1個の表面にフィブロネクチン―ゼラチン薄膜を形成させることにより、細胞間の接着足場を提供し、細胞を垂直方向に積層化できる三次元培養法である。三次元培養下でiPS細胞由来肝細胞の成熟化を行った際に、平面培養条件と比べて肝機能が向上するかを調べた。iPS細胞から肝幹/前駆細胞を分化誘導後、細胞を剥離し、細胞へ薄膜コーティングを行った。これら細胞をセルインサートに播種することで、三次元体を形成させた後、肝細胞成熟化培養条件下で培養を行った。その結果、単層で成熟化した系に比べ、薬物代謝酵素遺伝子の発現量が上昇した。その中でも特に、CYP2D6, CYP2C9, CYP1A1, CYP1A2の発現が5～15倍上昇した。さらに、体細胞からips細胞を経ず、直接的に肝細胞への分化誘導可能な手法の開発についても検討を行った。肝幹/前駆細胞のマーカーであるα-フェトプロテインプロモーターの下流にGFPを搭載したトランスジェニックマウスを入手し、このマウスの胎児繊維芽細胞(Afp-GFPMEF)を用いて直接的分化誘導実験を行った。Afp-GFPMEFに初期化リプログラミング遺伝子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を遺伝子導入し、partially-reprogrammingを起こし、そこから肝分化培養条件下で培養すると、約2週間後にGFPの蛍光を示す細胞が出現した。GFP陽性細胞をソーティングし、遺伝子発現を調べたところ肝幹前駆細胞様細胞が分化誘導できたことが分かった。

人诱导多能肝细胞（iPS细胞）可以分化为包括肝细胞在内的所有类型的细胞，因此有望应用于再生医学和药物体外毒性筛选系统。为了建立一种能够诱导人iPS细胞高效、高功能成熟肝细胞分化的方法，我们将在体外构建模拟体内肝脏环境的分化培养系统，并进行了研究。三维分化培养系统，可实现肝细胞和肝组织构成细胞的共培养。虽然三维培养方法有多种，但我们重点关注富集培养方法，因为共培养细胞和 iPS 细胞来源的分化诱导细胞之间的相邻面积很大，细胞和支架材料之间的相互作用可以忽略不计：尽可能多。该方法是一种三维培养方法，在每个细胞表面形成纤连蛋白-明胶薄膜，提供细胞之间的粘附支架，并允许细胞垂直堆叠。我们研究了与平面培养条件相比，当 iPS 细胞来源的肝细胞在三维培养下成熟时，肝功能是否得到改善。在诱导 iPS 细胞分化为肝干/祖细胞后，将细胞分离并在细胞上涂覆薄膜涂层。将这些细胞接种到细胞插入物上形成三维体，然后在肝细胞成熟培养条件下培养。结果，与单层成熟的系统相比，药物代谢酶基因的表达水平有所增加。特别是CYP2D6、CYP2C9、CYP1A1和CYP1A2的表达增加了5至15倍。此外，我们还研究了一种无需经过IPS细胞即可直接诱导从体细胞分化为肝细胞的方法的开发。我们获得了在α-胎蛋白启动子（肝干/祖细胞标记物）下游携带GFP的转基因小鼠，并使用该小鼠的胎儿成纤维细胞（Afp-GFPMEF）进行了直接分化诱导实验。将重编程基因（Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）导入Afp-GFPMEF中，引起部分重编程，然后在肝分化培养条件下培养约2周后，出现显示荧光的GFP细胞。当对GFP阳性细胞进行分选并检查基因表达时，发现可以诱导肝干祖细胞样细胞分化。