個体における概日時計制御機構の解析

个体生物钟控制机制分析

• 批准号: 12J00639
• 负责人: 田宮 寛之
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J00639/
• 关键词: 概日時計; 12灯用LED照度制御装置; ES分化誘導系; Per1とPer2の協調機構; 睡眠相前進症候群(FASPS); Per2ノックアウトレスキュー系; 短周期親和性PER1,長周期親和性PER2蛋白; 病的破綻; プロモーター; ES細胞; 分化誘導; 同調性

Per1とPer2は概日振動に必須の遺伝子であるが,両遺伝子の協調性に関しては未解明な部分が多い.本研究では新しい実験手法の開発とそれに基づく解析を行った.Per1,Per2各々のヘテロ,ホモノックアウトマウスを恒常明条件下で飼育した所,周期長はPer1とPer2の量比に依存しており,周期性消失はPer1,Per2の片方がないと起こりにくい事が示された.次に,位相応答が起きないような緩徐な光変化に対する個々のマウスの応答性を確認する為,12灯用LED照度制御装置を開発し,1分毎に任意のパターンの光をマウスに照射した際の概日リズム応答を検出可能な系を構築した.この装置を用いて22時間から27時間周期の緩徐に変化する光を照射した所,WTと比較してPer1(-/-)は長周期側に,Per2(-/-)は短周期側に,同調可能な周期の幅が広い事が示された.次にPer1とPer2の協調性を細胞レベルで検出する為,細胞レベルのPer2ノックアウトレスキュー系の構築を目指した.まず,ES細胞は概日リズムを持っていないが分化誘導をすると概日振動が発現することに着目し,ES細胞から10周期分の概日振動を検出し,小さな誤差で周期を測定可能な実験プロトコールを確立した.また,Per2 ノックアウトES細胞のRosa26にPer2遺伝子1コピーを正確に導入し,分化誘導することで,約24時間の振動を検出した.更に,Per2が原因遺伝子である睡眠相前進症候群(FASPS)の変異体を導入すると,個体同様に周期短縮が見られ,FASPS変異体の周期短縮を世界で初めて細胞レベルで再現する事に成功した.また,mut6変異体を導入するとFASPS同様の周期短縮がみられた.更にPer2 promoter下にPer1の翻訳領域を導入したところ,周期短縮が見られ,蛋白レベルの違いが周期親和性の違いを規定する事が示された.総じて,短周期親和性のPER1蛋白と長周期親和性のPER2蛋白は協調し,非生理的な環境条件下において概日周期長を24時間に限定する役割を持っている反面,低柔軟性のため病的破綻しうることを示した.

Per1和Per2是昼夜节律振荡的必需基因，但是这两个基因之间的合作还存在许多未知数。在本研究中，我们开发了一种新的实验方法，并在此基础上对杂合子和纯合子敲除小鼠进行了分析。恒定光照条件下，周期长度由 Per1 和 Per2 的量决定。研究表明，如果没有 Per1 或 Per2，周期性损失就不太可能发生。接下来，我们确认了个别小鼠对不引起相位响应的减慢光变化的响应能力。使用该装置，以22～27小时的周期照射缓慢变化的光，结果显示，与WT相比，Per1(-/-)处于较长周期侧，Per2处于较长周期侧。 /-)在短周期侧具有广泛的可同步周期。接下来，我们将在细胞层面检测Per1和Per2之间的配合。因此，我们的目标是在细胞水平上构建Per2敲除救援系统。首先，我们关注ES细胞不具有昼夜节律，但在诱导分化时会表达昼夜节律振荡的实验方案。可以检测昼夜节律振荡并以较小的误差测量周期。通过将 Per2 基因的一个拷贝准确地导入 Rosa26 敲除 ES 细胞中并诱导分化，我们检测到了大约 24 小时内的振荡。此外，我们检测到了一种突变形式的晚期睡眠阶段综合征 (FASPS)，其中 Per2 是当引入致病基因时，以与个体相同的方式观察到周期缩短，并且我们在世界上首次成功地在细胞水平上再现了FASPS突变体的周期缩短。引入后，观察到与 FASPS 类似的周期缩短。当Per1的翻译区被引入到启动子下时，观察到循环缩短，这表明蛋白质水平的差异决定了循环亲和力的差异。一般来说，PER1蛋白具有短循环亲和力和长循环亲和力。昼夜节律系统中的生物钟共同作用，在非生理环境条件下将昼夜节律周期长度限制为24小时，但由于其灵活性较低，可能会受到病理性的破坏。