高速ＡＦＭによる膜輸送タンパク質一分子の動的構造解析

使用高速 AFM 对单个膜转运蛋白分子进行动态结构分析

基本信息

批准号：
12J00228
负责人：
山下隼人
金额：
$ 2.53万
依托单位：
Osaka University (2014)Keio University (2012-2013)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いて疾患に関与する膜輸送タンパク質1分子を直接可視化する事により、構造ダイナミクスや分子間相互作用を捉え、疾患発症の分子メカニズム解明に繋げる事が目的である。本年度の研究実績を以下に記述する。1. ABCトランスポーター1分子の構造解析昨年度までに構築した測定条件をもとに、ABCトランスポーターの中で唯一のイオンチャネルであり、嚢胞性線維症(CF)の原因タンパク質であるCFTRの1分子観察とその構造解析を行った。CFTRはパッチクランプ法を用いた電流計測により細胞膜中で単量体として機能する事が示唆されてきたが、構造状態に関しては依然として議論が続いていた。高速AFMによる解析の結果、可溶化状態ではほとんどが2量体で、再構成膜中ではほとんどが単量体である事が強く示唆された。これはCFTRの機能ユニットに関する議論に構造的証拠を与えるものと考えられる。2. アクアポリン4(AQP4)の分子集合と「自己免疫疾患」初期分子過程の解明AQP4は脳のアストロサイトで多量に発現し、自己免疫疾患である視神経脊髄炎(NMO)に関与している。そこで、NMO初期過程の分子レベルでの可視化に取り組んだ。昨年度AQP4M23のアレイ集合の可視化に成功したが、本年度はM1を観察した結果、ほとんどのAQP4-4量体が離散分布で、一部がクラスター集合している様子の撮影に成功した。そこで、それぞれにAQP4モノクロナル抗体やNMO-IgGを投与して高速AFM観察を行った結果、アレイのM23やクラスターのM1上では抗体がBivalentに結合し、抗体1分子中の2つのFabを使って、集合AQP4上を（歩くように）ダイナミックに移動している様子が観察された。これらの結果から、AQP4の集合状態が疾患発症の初期過程である抗体結合の親和性に強く関係している事が示唆された。

该研究利用高速原子力显微镜（高速AFM）直接观察与疾病相关的膜转运蛋白的单分子，从而捕获其结构动力学和分子间相互作用，从而阐明其潜在的分子机制疾病的发生就是目的。现将今年的研究成果介绍如下。 1. ABC转运蛋白1分子的结构分析根据去年建立的测量条件，我们对ABC转运蛋白中唯一的离子通道和囊性纤维化（CF）的致病蛋白CFTR的结构进行了分子观察和分析。结构分析。尽管通过膜片钳方法的电流测量表明CFTR在细胞膜中作为单体发挥作用，但对其结构状态仍存在争议。高速AFM分析强烈表明，在溶解状态下，大部分物质是二聚体，而在重构膜中，大部分物质是单体。这可能为有关CFTR功能单元的讨论提供结构证据。 2. 阐明水通道蛋白4（AQP4）的分子组装和“自身免疫性疾病”的早期分子过程 AQP4在大脑星形胶质细胞中大量表达，并参与自身免疫性疾病视神经脊髓炎（NMO）。因此，我们致力于在分子水平上可视化最初的 NMO 过程。去年，我们成功地可视化了AQP4M23的阵列组装，但今年，通过观察M1，我们成功地拍摄到大多数AQP4四聚体呈离散分布，也有一些呈簇状分布。因此，我们分别给予AQP4单克隆抗体或NMO-IgG并进行高速AFM观察，结果抗体与阵列的M23和簇的M1上的二价结合，并且一个抗体分子中的两个Fab被结合。观察到它在 AQP4 上动态移动（就像行走一样）。这些结果表明AQP4组装状态与抗体结合亲和力密切相关，这是疾病发作的早期阶段。