ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いたキナーゼ－基質ペア情報の網羅的探索とデータマイニング

使用 LC-MS/MS 全面搜索和数据挖掘激酶-底物对信息

• 批准号: 11J04786
• 负责人: 今村 春菜
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J04786/
• 关键词: プロテオーム; リン酸化; 質量分析; タンパク質キナーゼ; シグナル伝達

本研究ではタンパク質キナーゼと基質の関係性を明らかにすることを目的とし、in vitroキナーゼ法とLC-MS/MS解析を組み合わせた手法を試みた。昨年度は、本手法をc-AMP regulated protein kinase A (PKA)、extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1)、およびRAC-alpha serine/threonine protein kinase (AKTl)の三種のキナーゼに適用した。その結果、PKA、ERK1およびAKT1の基質リン酸化部位として、それぞれ3,585、4,374、および1,778種のリン酸化部位が同定された。今年度は、昨年度に得られた大量のリン酸化部位から情報抽出を行い、各キナーゼが基質認識する際に重要となる要素を明らかにした(研究1)。その結果、得られたデータの情報量の豊富さゆえ、公共データベース登録のあった既知リン酸化部位情報と比べると、より詳細なモチーフ配列の検出が可能となった。大規模基質プロファイルから抽出したモチーフ配列は、既知リン酸化部位より同定されたモチーフ配列のみならず、キナーゼ特異的なモチーフを含む新規のモチーフ配列を多数含んでいた。また、同じキナーゼファミリーであるPKAとAKT1のモチーフ配列間での選択性評価から、既知基質情報の欠如が選択性の低いモチーフ配列の同定の原因となるという具体的な事例を示した。更に、モチーフ配列のみならず、リン酸基受容体(SまたはT)やリン酸基自身に対するキナーゼの選択性といった、その他の基質認識要素を示唆した。続いて、PKAの阻害薬あるいは活性化薬にて刺激した細胞由来のタンパク質消化物に対してLC-MS/MS解析を行った研究2)。細胞内ではシグナル伝達が行われるため、これらの結果には、PKAの直接的また間接的なin vivo基質が共に含まれる。そこで、研究1で獲得したPKAのin vitro基質プロファイルを用いて、in vivo細胞内のPM直接基質の特定を試みた。その結果、本手法によって20以上のリン酸化部位がPKAの直接基質として同定された。

在本研究中，我们尝试了一种将体外激酶方法与LC-MS/MS分析相结合的方法，旨在阐明蛋白激酶和底物之间的关系。去年，我们将该方法应用于三种类型的激酶：c-AMP调节蛋白激酶A（PKA）、细胞外信号调节激酶1（ERK1）和RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）。结果，分别鉴定出3,585、4,374和1,778种磷酸化位点作为PKA、ERK1和AKT1的底物磷酸化位点。今年，我们从去年获得的大量磷酸化位点中提取信息，阐明了每种激酶识别底物时的重要元素（研究1）。因此，所获得的丰富数据使得比公共数据库中注册的已知磷酸化位点信息更详细地检测基序序列成为可能。从大规模底物谱中提取的基序序列不仅包括从已知磷酸化位点鉴定的基序序列，还包括许多新颖的基序序列，包括激酶特异性基序。此外，通过评估属于同一激酶家族成员的PKA和AKT1基序序列之间的选择性，我们展示了由于缺乏已知底物信息而导致基序序列识别选择性低的具体情况。此外，还提出了其他底物识别元件，不仅是基序序列，还包括激酶对磷酸基受体（S 或 T）或磷酸基本身的选择性。接下来，一项研究对来自用 PKA 抑制剂或激活剂刺激的细胞的蛋白质消化物进行了 LC-MS/MS 分析2)。由于信号转导发生在细胞内，因此这些结果包括 PKA 的直接和间接体内底物。因此，利用研究 1 中获得的 PKA 体外底物谱，我们尝试鉴定体内细胞中的直接 PM 底物。结果，使用该方法鉴定了 20 多个磷酸化位点作为 PKA 的直接底物。

项目成果

A systematic survey of protein kinase specificity by in vitro phosphoproteomic approaches

通过体外磷酸化蛋白质组学方法对蛋白激酶特异性进行系统调查

• 发表时间: 2012
• 作者: Haruna Imamura; Naoyuki Sugiyama; Masaki Wakabayashi; Yasushi Ishihama
• 通讯作者: Yasushi Ishihama

リン酸化プロテオミクスを用いたタンパク質キナーゼの基質認識における特異性評価

使用磷酸蛋白质组学评估蛋白激酶底物识别的特异性

• 发表时间: 2011
• 作者: 今村春菜;杉山直幸;若林真樹;中野実;石濱泰
• 通讯作者: 石濱泰