トキソプラズマ原虫の潜伏感染を制御する原虫プロテインキナーゼの機能解析

控制弓形虫潜伏感染的原生动物蛋白激酶的功能分析

基本信息

批准号：
11J02037
负责人：
杉達紀
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

TgMAPK1がトキソプラズマの生態に果たす役割を解析するために、TgMAPK1の染色体位置上に変異を導入した。発現誘導が可能である、Destabilizing Domain (DD)タグをタンパク質N-末に融合した形で発現するように組換に成功した。DDタグが付加されたTgMAPK1はDDタグの低分子リガンドであるshield-1存在下において、濃度依存的にタンパク質の蓄積量の増加した。Shield-1の処理により強発現となったDDタグ融合TgMAPK1は原虫の生育を止めたことから、DD-TgMAPK1がDDタグの存在により機能を損なっていることが示唆された。HAタグをN末に付加したTgMAPK1に種々の変異を導入した配列により、原虫が持つTgMAPK1位置でノックインした原虫を作成した。低分子化合物であるBKIの一つである1NM-PP1による感受性が変化する感受性決定アミノ酸位置が、G, A, T, F, Yのそれぞれのアミノ酸に置換された変異体を作出した。Alanineを感受性決定アミノ酸に持つTgMAPK1をコードする組換原虫RH/TgMAPK1Aは、1NM-PP1により低濃度(100nM以下)で増殖が阻止されたのに対して、Tyr。sineを持つTgMAPK1をコードする組換原虫RH/TgMAPK1Yは耐性を獲得していた。1NM-PP1処理時において、核のDNA量の変化についてフローサイトメトリーで観察した。その結果RH/TgMAPK1AとRH/TgMAPK1Yともにゲノム複製の完了を示す細胞内DNA量2Nまでは相違なく進んだが、RH/TgMAPK1A (1NM-PP1感受性株)においては核分裂および細胞分裂期の進行を示す1NのDNA量を持った細胞が減少した。これは、TgMAPK1がDNA合成以降の細胞周期の中でチェックポイントとして働いていることを示唆している。

为了分析 TgMAPK1 在弓形虫生态中发挥的作用，我们在 TgMAPK1 的染色体位置引入了突变。我们成功地重组了该蛋白质，以表达融合到该蛋白质 N 末端的去稳定域 (DD) 标签，该标签可以诱导表达。在存在 DD 标签的小分子配体shield-1 的情况下，带有 DD 标签的 TgMAPK1 的蛋白质积累以浓度依赖性方式增加。 DD 标签融合的 TgMAPK1 在 Shield-1 处理后强烈表达，阻止了寄生虫的生长，表明 DD-TgMAPK1 的功能因 DD 标签的存在而受损。我们通过在 TgMAPK1 中引入各种突变，在寄生虫的 TgMAPK1 位置创建了一种敲入寄生虫，TgMAPK1 在 N 末端添加了一个 HA 标签。我们创建了突变体，其中改变对 1NM-PP1（一种低分子量 BKI）敏感性的敏感性决定氨基酸位置被 G、A、T、F 和 Y 氨基酸取代。编码 TgMAPK1 的重组原生动物 RH/TgMAPK1A 以丙氨酸作为敏感性决定氨基酸，在低浓度（100 nM 或更低）下被 1NM-PP1 抑制生长，而 Tyr.编码正弦TgMAPK1的重组原生动物RH/TgMAPK1Y获得了抗性。用1NM-PP1处理后，通过流式细胞术观察核DNA含量的变化。结果，RH/TgMAPK1A和RH/TgMAPK1Y的细胞内DNA水平都进展到2N，这表明基因组复制完成，但RH/TgMAPK1A（1NM-PP1敏感菌株）达到1N，这表明核分裂和细胞进展分裂阶段，含有此量 DNA 的细胞数量减少。这表明 TgMAPK1 在 DNA 合成后充当细胞周期中的检查点。