臨床応用を目指した痛みの遺伝子治療の基盤的研究開発

以临床应用为目标的疼痛基因治疗的基础研究和开发

基本信息

批准号：
22K09016
负责人：
神田浩嗣
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09016/
关键词：
GABA 遺伝子治療神経障害性疼痛ウイルスベクターアデノウイルス

项目摘要

近年、遺伝子治療は様々な分野で注目されており、臨床応用が開始されている分野もあるが、ペインクリニックにおいては痛みの遺伝子治療は確立されていない。これまでに代表者は痛みの遺伝子治療の有用性やその鎮痛機序を解明する研究成果を継続的に報告してきた。本研究はグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)67を発現させ脊髄後角のγ-アミノ酪酸 (GABA) 合成を促進するウイルスベクターを用いた遺伝子治療の有用性を明らかにし、そのメカニズムを解明することを目的としている。本研究は、以下の１）～３）に示す研究内容から構成されている。１）GABA産生の促進のためGAD67を導入するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作成する。作成したAAVベクターには、神経細胞特異的に標的遺伝子を発現させるためのプロモーターを装備させ、神経組織でのみGABA産生が促進する機能を付加させる。２）作成したAAVベクターの機能評価を行う。機能評価には初代培養神経細胞および実験動物（ラット）を用いる。３）疼痛モデルにAAVベクターを投与して行動解析を用いて疼痛閾値を経時的に測定し、その鎮痛効果と分子生物学的機序を調べる。2022年度の研究実績：１）の研究を行った。その方法と共にその結果を次に示す。緑色蛍光タンパク質（GFP）をサイトメガロウイルス（CMV）またはシナプシンI （SYN）プロモーター制御下で発現するAAVベクターを作成した。この2種のAAVベクターをラットに髄注しPCR法及び免疫染色法を用いて脊髄における導入遺伝子の発現を調べた。PCR法においては両群でラット脊髄のGFP発現が誘導された。免疫染色法では、SYN-AAVベクター投与群でのみ神経細胞特異的なGFP発現が認められた。SYNプロモーターを持つAAVベクターはラット脊髄の神経細胞へ特異的に標的遺伝子を導入する性質を持つことが明らかになった。

近年来，基因治疗受到各领域关注，部分领域已开始临床应用，但针对疼痛的基因治疗尚未在疼痛临床建立。迄今为止，代表们不断报道阐明基因治疗疼痛的有效性及其镇痛机制的研究成果。本研究的目的是阐明使用表达谷氨酸脱羧酶（GAD）67并促进脊髓背角γ-氨基丁酸（GABA）合成的病毒载体进行基因治疗的有用性，并阐明其机制。据说本研究由以下1）～3）所示的研究内容组成。 1) 创建腺相关病毒 (AAV) 载体，引入 GAD67 以促进 GABA 产生。所创建的 AAV 载体将配备一个启动子，可以在神经细胞中特异性表达靶基因，并且能够仅在神经组织中促进 GABA 的产生。 2) 对创建的 AAV 载体进行功能评估。原代培养的神经元和实验动物（大鼠）用于功能评估。 3) 将AAV载体应用到疼痛模型中，使用行为分析测量随时间变化的疼痛阈值，并研究其镇痛效果和分子生物学机制。 2022年研究成果：1）进行了研究。方法和结果如下所示。我们创建了一个在巨细胞病毒 (CMV) 或突触蛋白 I (SYN) 启动子控制下表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的 AAV 载体。将这两种类型的AAV载体鞘内注射到大鼠体内，并使用PCR和免疫染色方法研究导入基因在脊髓中的表达。 PCR方法中，两组大鼠脊髓均诱导GFP表达。免疫染色显示仅在 SYN-AAV 载体施用组中存在神经元特异性 GFP 表达。研究表明，含有SYN启动子的AAV载体具有将靶基因特异性导入大鼠脊髓神经元的能力。